프로테오글리칸 시각화를 위한 Alcian Blue 염색: 중간엽 줄기세포 분화된 연골세포 배양에서 프로테오글리칸을 검출하는 기술 in vitro

초록

출처: Schlaefli, P. et al., 응고된 골수 샘플에서 중간엽 줄기세포를 구출하는 효소 방법. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 기능성 연골 세포에 의해 분비되는 프로테오글리칸을 찾기 위한 알시안 블루 염색 절차를 설명합니다. 이 방법은 중간엽 줄기 세포를 성숙한 연골 세포로 체외 분화의 성공 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

참고: 장골능에서 추출한 개의 골수 흡인은 개 주인의 동의하에 수집되었습니다. 송곳니(약 10ml) 골수 흡인은 수술실에서 채취 직후 3.8% 구연산나트륨 15ml를 첨가하여 항응고되었습니다. 샘플은 채취한 당일에 처리를 위해 실험실 환경으로 옮겨졌습니다.

1. 우로키나아제의 준비 (1회 사용 전)

1. 제조업체의 지침에 따라 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 우로키나아제를 재구성합니다: 10ml 주사기를 사용하여 격막 주입 플라스크에 10ml PBS를 추가합니다. 건조 물질을 소용돌이쳐 용해시켜 ml당 50,000 주입 단위(U)를 얻습니다.
2. 500μl 분취량(각 25,000U)을 멸균 튜브에 준비합니다. 부분 표본은 -20 °C로 보관하고 최소 6개월 동안 필요할 때 사용합니다.

2. 준비 단계 (모든 골수 치료 전)

1. 응고된 골수 흡인당 우로키나아제(25,000 U) 분취액 1개를 해동합니다(25,000 U의 단일 분취액을 사용하여 최대 25ml의 흡인 부피를 성공적으로 처리함).
2. 수조 또는 진탕 인큐베이터를 37°C로 예열합니다.

3. 혈전의 효소 분해

1. 처리 중 골수 샘플의 미생물 오염을 방지하기 위해 층류 생물 안전 캐비닛에서 모든 작업을 수행합니다. 감염 가능성이 있는 인체 물질로 작업할 때는 보호 장갑을 사용하고 조심스럽게 취급하는 것이 좋습니다.
2. 멸균된 50ml 튜브 위에 100μm 세포 여과기를 놓습니다. 세포 여과기를 통해 골수 흡인을 조심스럽게 붓고 여과기를 기울이거나 혈전 물질 주위를 이동합니다. 필터 메쉬를 통한 더 나은 흐름을 위해 멸균 피펫 팁을 사용하십시오.
   메모: 예를 들어 PBS로 혈전을 세척하여 혈전이 희석되지 않도록 합니다. 우로키나아제는 간접적으로 작용하며 효과적인 소화를 위해 생검에서 혈청의 구성 요소(즉, 플라스미노겐)를 필요로 합니다. 응고 물질로 절차를 계속하는 동안 여과액은 3.6단계에서 추가로 사용할 때까지 RT로 유지할 수 있습니다.
3. 골수 응고 물질을 멸균 겸자를 사용하여 빈 세포 배양 접시에 옮깁니다. 멸균 메스를 사용하여 파편을 약 2mm³의 작은 조각으로 자릅니다.
4. 멸균 겸자를 사용하여 혈전의 작은 조각을 50ml 반응 튜브로 옮깁니다. 다진 응고가 젖은 것처럼 보이는지 확인하십시오. 건조된 것 같으면 3.1단계의 여과액 중 일부를 사용하여 촉촉하게 하십시오.
5. 5ml 마이크로타이터 피펫을 사용하여 위아래로 5회 피펫팅하여 혈전을 분쇄합니다. 샘플에 urokinase 부분 표본 1개를 추가합니다. 37 °C에서 30분 동안 수조 또는 (부드럽게) 흔드는 인큐베이터에서 배양합니다.
6. 5 ml 피펫을 사용하여 위아래로 5회 피펫팅하여 분쇄합니다. 생물 안전 작업대에서 이 단계를 수행합니다. 37°C에서 30분 더 배양합니다. 배양 후 5ml 피펫을 사용하여 다시 5회 분쇄합니다. 새로운 100μm 세포 스트레이너를 3.2단계의 여과액과 함께 풀링합니다.
7. 세포 현탁액을 상온에서 500 x g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 아래 설명된 대로 또는 MSC 확장 배양을 위한 실험실의 표준 절차에 따라 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

4. 확장 세포 배양 및 CFU 플레이트를 위한 파스팅

1. 50ml의 기저 배지에 세포(적혈구 및 단핵 세포로 구성됨)를 재현탁시킵니다: 10% 소 태아 혈청(FBS), 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 및 2.5mg/ml 암포테리신 B가 보충된 알파-MEM. Neubauer 챔버를 사용하여 Trypan Blue 용액에서 1:10으로 희석된 세포를 계수합니다.
2. 세포 배양 플라스크에 5 x 10⁷ cells/cm²의 밀도로 세포를 플레이트화하고 37°C의 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 가능한 경우 저산소(5% 산소) 조건을 사용합니다. CFU 분석 대조군의 경우, 직경 10cm의 세포 배양 접시에 10⁹ 세포를 플레이트화합니다.
3. 배양 3일 후, 중간엽 줄기세포는 세포 배양 접시에 부착되고 다른 세포는 현탁 상태를 유지합니다. 5ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 보충된 기저 배지로 배지를 변경합니다. CFU 분석 대조군의 경우 세포 배양 접시도 마찬가지로 처리합니다.
4. 총 2주 동안 세포 배양을 계속하며 일주일에 3회 배지를 교환합니다. 세포가 80% 포화도를 초과하면 트립신화로 분열합니다. CFU 분석 대조군의 경우에도 마찬가지로 배지를 교환하되 2주 동안 세포를 분할하지 마십시오.

5. MSC 차별화

1. 개의 MSC 분화
   메모: 개 MSC는 4주 동안 적절한 배지로 자극하여 연골형성(chondrogenic), 골형성(osteogenic) 및 지방생성(adipogenic) 계통으로 분화되었습니다.
2. 연골형성 분화
   1. 동결건조된 콜라겐 I형으로 구성된 스펀지 모양의 의료 기기에서 큐브(한 면당 3mm)를 자르고 세포를 지지하는 골격 재료로 사용합니다.
   2. 4 x 10⁶ cells/ml(~70,000 cells/cube)의 농도로 큐브 상단에 MSC를 파종합니다.
   3. 배지를 추가하기 전에 세포가 30분 동안 큐브에 부착되도록 합니다.
   4. DMEM/F12 + GlutaMAX, 2.5 % FBS, 100 units/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 2.5 μg/ml 암포테리신 B, 40 ng/ml 덱사메타손, 50 μg/ml 아스코르브산 2-인산염, 50 μg/ml L-프롤린, 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 X 및 10 ng/ml 형질전환 성장 인자-β1로 구성된 연골 생성 배지에서 MSC-콜라겐 구조를 유지합니다.
   5. alcian blue staining을 사용하여 구성 섹션에서 프로테오글리칸의 축적을 시각화합니다. 간단히 말해서, 0.01% H₂SO₄ 및 0.5M 구아니딘 염산염에 용해된 0.4% 알시안 블루로 O/N 섹션을 염색합니다. 다음으로, 절편을 40% DMSO 및 0.05M_MgCl2에서 30분 동안 세척하였다. 세포는 핵 빠른 적색으로 대조 염색되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
기초 매체 성분
펜스트렙 100X	지브코	15140122
인간 FGF-basic	페프로텍	100-18B
MEM 알파 w/ 뉴클레오시드, w/안정 글루타민	아미메드	1-23S50-나
FBS 열이 비활성화됨	아미메드	2-01F36-나
암포테리신 B	애플리켐	대답1907
지방생성 매체 성분
DMEM-HAM F12 + 글루타맥스	아미메드	1-26F09-나
연골 형성 매체 성분
Biopad - 스펀지 형태의 의료기기	유로리서치
L-프롤린	시그마	P5607
인슐린-트랜스페린-셀레늄 X	지브코	51500056
인간형전환성장인자-β1	페프로텍	100-21
알시안 블루 8 GX	시그마	A3157
핵 빠른 빨간색	시그마	N8002
일반 Tri-Sodium citrate 이수화물	애플리켐	A3901
PBS (PBS)	애플리켐	964.91
황산(H2SO4)	애플리켐	A0655
디메틸설폭사이드(DMSO)	애플리켐	대답1584
염화마그네슘(MgCl2)	애플리켐	A3618
구아니딘 염산염	애플리켐	대답1499
소모품
50ml 반응 튜브	액시겐	SCT-50ML-25-S
주사기 10ml	브라운	4606108V
스테리칸 바늘 (22G)	브라운	4657624
1.7ml 마이크로튜브	브룬슈비히	MCT-175-C
100μm 셀 스트레이너	송골매	6.05935
멸균 겸자	바스토스 비에가스, 남호주	Tel.489-001
멸균 메스	브라운	5518059
Primaria 세포 피부 접시	송골매	353803
C-Chip Neubauer 개선	바이오스위스텍	505050
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