수단 IV 염색: 수확된 마우스 대동맥궁에서 지질이 함유된 죽상경화성 플라크를 염색하는 절차

초록

출처: Centa, M., et al. 마우스의 죽상동맥경화증 정량화. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 수단 IV 염색을 사용하여 적출된 쥐 대동맥궁의 지방 침전물을 염색하여 죽상경화성 플라크를 시각화하고 죽상동맥경화증의 정도를 결정하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 대동맥궁 및 완두동맥의 안면 분석

1. 대동맥궁의 면 분석을 위한 피닝 베드를 준비합니다. 파라핀 왁스 필름 세그먼트를 8번 접어 평평한 25mm x 25mm 표면을 만듭니다. 검은색 전기 절연 테이프로 감싸 대동맥의 어두운 배경을 만듭니다. 고정 침대 뒷면에 라벨을 붙이고 연필을 사용하여 마우스 식별 번호를 씁니다(일반 펜 잉크는 염색 과정에서 사라집니다).
2. 대동맥궁을 고정 침대로 옮기고 그 위에 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다. 실체현미경으로 남아있는 외곽주위 지방 조직에서 대동맥을 청소하기 시작합니다.
   1. Vannas 가위와 Dumont 집게를 사용하여 대동맥을 조작하거나 손상시키지 않고 주변의 모든 지방 조직을 부드럽게 벗겨냅니다. 수단 IV는 지방 조직을 밝게 염색하므로 이 시점에서 이러한 조직을 모두 제거하는 것이 중요합니다.
      메모: 대동맥을 항상 촉촉하게 유지하고 필요할 때 추가 PBS를 바르십시오.
3. 대동맥 내강에 Vannas 가위를 삽입하여 내부 표면을 노출시켜 관상동맥 평면의 대동맥을 절단합니다. 원위 방향으로 상승궁의 바깥쪽 곡률을 절단하기 시작하고 상완두동맥을 포함한 가지를 계속 절단하여 엽니다. 하강하는 흉부 부위의 등쪽 부분을 남겨둡니다.
   1. 더 작은 곡률을 잘라내고 대동맥을 접어 열어 내부 표면을 표시합니다.
      메모: 이 단계에는 소근육 운동 기술이 필요하며 마스터하려면 약간의 연습이 필요합니다.
4. minutien 곤충 핀의 뭉툭한 끝을 사용하여 열린 아치를 고정 침대에 고정합니다. 마이크로 Castroviejo 바늘 홀더를 사용하여 핀을 제자리에 끼웁니다. 제자리에 있을 때 핀을 표본에서 부드럽게 구부립니다. 표본을 늘리지 않고 대동맥을 침대에 평평하게 고정합니다. 4 °C에서 PBS로 채워진 페트리 접시에 아래쪽을 향하도록 고정한 아치를 보관하십시오.
   메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
5. 수단 IV의 작업 솔루션을 준비하십시오. 어두운 병에 수단 IV 분말 1g, 70% 에탄올 100mL, 아세톤 100mL를 섞고 10분 동안 부드럽게 저어줍니다. 용액을 여과할 필요가 없으며 실온에서 어둡게 보관하면 몇 달 동안 사용할 수 있습니다. 염색 색상이 만족스럽지 않으면 새로운 용액을 만들고 시편을 다시 염색할 수 있습니다.
   주의: 아세톤은 눈에 심각한 자극을 유발할 수 있는 가연성 액체입니다. 환기가 잘 되는 곳에 보관하고 취급 시 예방 조치를 취하십시오.
6. 실험실 벤치에 5개의 페트리 접시를 배열합니다: 하나는 70% 에탄올로 채워져 있고, 하나는 수단 IV 작업 용액으로 채워져 있고, 다른 하나는 80% 에탄올로 채워져 있고, 다른 하나는 PBS로 채워져 있습니다.
   1. 아치가 아래를 향하도록 첫 번째 페트리 접시에 고정 베드를 놓고 70% 에탄올에 표본을 5분 동안 헹굽니다. 표본을 수단 IV 작업 용액으로 옮기고 7분 동안 아치를 염색합니다.
   2. 다음으로, 80% 에탄올을 3분 동안 두 번 헹구어 정상적인 내막 표면을 제거합니다. 결과를 최적화하기 위해 탈색 시간을 조정할 수 있습니다. 마지막으로, 표본을 원래의 페트리 접시에 다시 넣기 전에 PBS로 헹굽니다.
7. 디지털 카메라에 연결된 10배 배율의 실체 현미경을 사용하여 현미경 사진을 획득합니다. 작은 금속 무게(20mm x 10mm x 5mm)를 사용하여 PBS에 잠긴 고정된 아치의 사진을 찍어 고정 베드를 페트리 접시 바닥에 고정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
검은색 전기 절연 테이프(폭 50mm)	모든 전문 소매업체		대동맥궁을 위한 고정 침대를 만듭니다.
해부 가위 (10cm, 스트레이트)	세계적인 정밀 기기	14393	장기의 일반적인 해부용.
뒤몽 겸자 # 5 (11cm, 스트레이트)	세계적인 정밀 기기	500341	대동맥 현저박리용.
에탄올 70% (v/v)	VWR 화학 물질	83801.29	인화성이 높은 액체 및 증기는 통풍이 잘되는 곳에 보관하고 서늘하게 보관하십시오.
에탄올 절대 ≥99.8%	VWR 화학 물질	제20821.31	인화성이 높은 액체 및 증기는 통풍이 잘되는 곳에 보관하고 서늘하게 보관하십시오.
포름알데히드 4% 안정화, 완충(pH 7.0)	VWR 화학 물질	9713.1	흡입, 피부 접촉 또는 삼키면 유해합니다.
이소프로파놀	머 크	1096341011	인화성 액체는 눈에 심한 자극을 일으키고 졸음이나 현기증을 유발할 수 있습니다.
마이크로 Castroviejo 바늘 홀더 (9cm, 직선)	세계적인 정밀 기기	503376	대동맥궁 고정용.
Minutien 곤충 핀, 0.10mm	정밀 과학 도구	26002-10	대동맥궁 고정용.
파라필름 M	베미스	미세먼지992	대동맥궁을 위한 고정 침대를 만드는 데 사용되는 파라핀 왁스 필름.
인산염 완충 식염수(PBS)	-	-	Sterile 및 RNase-free 용액은 마우스의 관류를 위해 필요합니다
실체현미경	라이카 마이크로시스템즈	MZ6	해부 및 얼굴 문서화용
수단 IV	시그마-알드리치	S4261 (영어	유해 물질 또는 혼합물로 분류되지 않습니다.
Vannas 가위 (8cm, 스트레이트)	세계적인 정밀 기기	503378	대동맥 현저박리용.

년 호 년 . )