리그닌 시각화를 위한 Wiesner 염색: 애기장대 탈리아나의 줄기에 존재하는 리그닌 침전물을 염색하는 기술

초록

출처: Pradhan Mitra, P. et al., Arabidopsis thaliana 2차 세포벽 요소의 조직화학적 염색. J. Vis. 특급 (2014).

이 비디오에서는 특수 식물 세포에 존재하는 리그닌을 염색하기 위한 Wiesner 염색 기술에 대해 설명합니다. 이 염색 기술은 애기장대 탈리아나 줄기에서 리그화된 세포벽을 시각화하는 데 도움이 되며 다양한 유형의 세포 세포벽에서 리그니화를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 스템 임베딩

1. 물에 7% 아가로스 용액을 만듭니다(증류수 100ml에 전기영동 등급 아가로스 7g). 아가로스를 20분 동안 고압증기멸균하거나 가장 낮은 강도(예: 1,250와트 전자레인지의 10% 강도)에서 20분 동안 전자레인지에 돌려 아가로스를 용해시킵니다.
2. 플라스틱 바이알을 사용하여 줄기를 삽입하기 위한 수제 금형을 준비합니다.
   1. 면도날을 사용하여 2ml 나사 캡 미세 원심 분리기 튜브(파트 A)의 원뿔형 바닥을 잘라냅니다. 주사기 바늘을 사용하여 삽입할 줄기의 직경보다 약간 큰 튜브 캡에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브(파트 B)의 바닥에서 0.5cm 떨어진 곳을 자릅니다.
   2. 0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브의 절단된 0.5cm 부분을 미리 절단된 2ml 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 파라필름을 사용하여 두 부분을 밀봉합니다(그림 1).
      메모: 튜브의 바닥은 아가로스가 응고된 후 포함된 샘플을 쉽게 제거할 수 있도록 절단됩니다. 캡의 구멍은 줄기가 아가로스에 박혀 있을 때 줄기를 안정적으로 유지하는 데 도움이 됩니다. 곰팡이는 아가로스를 고정하고 매립할 때 줄기를 똑바로 유지하는 역할을 합니다. 파라필름은 아가로스가 설정되고 줄기가 삽입될 때까지 A와 B의 두 부분을 유지합니다.
   3. 면도날을 사용하여 관심 영역(예: 첫 번째 줄기 마디의 중간)에서 줄기 부분을 자릅니다.
      메모: 이상적으로는 탈수로 인한 파괴를 피하기 위해 매립 직전에 줄기를 절단해야 합니다. 또는 스템을 물에 적신 여과지가 들어있는 플레이트에 임시로 보관할 수 있습니다. 이 플레이트는 조직 탈수 및 변형을 방지하기 위해 내장할 준비가 될 때까지 얼음 위에 놓을 수 있습니다. 수분이 많지 않은 상태에서 30분 이상 줄기를 보관하면 줄기가 건조해집니다.
3. 아가로스를 전자레인지에 저강도로 녹입니다.
   주의: 아가로스가 들어 있는 병은 뜨거울 수 있습니다. 장갑을 사용하여 병을 집습니다. 녹인 아가로스를 약 20°C로 식을 때까지 실온(25°C에서 50°C 사이)으로 두십시오.
4. 미리 만들어진 플라스틱 틀에 아가로스 5ml를 천천히 피펫으로 넣어 바이알을 채웁니다.
   메모: 금형에 기포가 없는지 확인하십시오. 기포는 아가로스 주형에 틈을 일으키고 줄기 샘플을 완전히 덮지 않아 결국 샘플 단면의 고르지 않은 절단으로 이어질 것입니다.
   1. 아가로스를 30-60초 동안 식혀 반고체가 되도록 합니다. 작은 이쑤시개로 테스트하여 아가로스에서 침투하고 일어설 수 있지만 뜨지 않는지 확인하십시오.
      메모: 아가로스가 아직 뜨거울 때 줄기를 배치하면 줄기를 쪼그라들어 세포 형태를 파괴하여 샘플을 손상시킵니다.
   2. 아가로스로 채워진 이 바이알에 줄기를 넣습니다. 줄기가 똑바로 유지되는지 확인하십시오. 구멍이 뚫린 캡을 스템의 끝이 캡에 고정되도록 놓습니다. 나사식 캡을 돌리지 마십시오. 때로는 하나 이상의 줄기(단일 종류)가 단일 바이알에 내장될 수 있습니다. 그러나 이 경우 cap.
      를 사용하지 마십시오. 메모: 나사식 캡을 돌리면 스템이 꼬입니다.
5. 바이알이 굳을 때까지 10-30분 동안 바이알을 실온 또는 4°C로 두십시오.
6. 튜브에서 부드럽게 밀어 금형을 제거합니다. 파라필름을 엽니다. 엄지 손가락으로 금형의 B 부 바닥을 부드럽게 밀어 A 부의 응고된 아가로스를 유리 현미경 슬라이드로 분리합니다.
7. 아가로스가 박힌 줄기를 길이가 1.2cm인 거의 같은 세 조각으로 자릅니다. 아가로스에 없는 줄기 부분을 잘라내어 버립니다.
   밀폐된
   1. 2ml 마이크로 원심분리기 튜브에 줄기가 박힌 아가로스 조각을 절단할 준비가 될 때까지 4°C의 어두운 상자에 보관하십시오. 또는 튜브를 최대 1주일 동안 4°C에서 보관하십시오.
      메모: 저장은 가능하지만 실험자는 포함된 스템이 여전히 살아 있고 실험에 따라 아티팩트가 잠재적으로 도입될 수 있음을 인식해야 합니다.

2. 스템 단면화

주의: 비브라톰 설명서를 주의 깊게 읽고 모든 안전 지침을 따르십시오.

1. 시편 디스크가 깨끗하고 완전히 건조되었는지 확인하십시오(고체 또는 액체가 없음). 면도날로 표본 디스크를 청소하여 이전 실험에서 잔여 접착제를 제거하고 물로 씻습니다. 그런 다음 종이 타월로 말리십시오.
   메모: 이렇게 하면 접착제가 잘 작동하고 아가로스 표본에 결합됩니다. 이 단계를 제대로 수행하지 않으면 시편이 디스크에 부착되지 않을 수 있으며 나중에 절단 중에 시편이 디스크에서 떨어질 수 있습니다.
   1. 부드러운 종이 물티슈를 사용하여 표본이 들어 있는 아가로스 블록에서 수분을 제거합니다.
   2. 표본 디스크에 조직 접착제를 한 방울 떨어뜨립니다.접착 병의 끝을 사용하여 플레이트 중앙 영역을 덮도록 접착제를 줄무늬 제거. 아가로스 블록을 빠르게 배치하여 표본이 각각 횡단 또는 세로 단면을 위해 플레이트에 수직 또는 평행이 되도록 합니다. 접착제가 샘플을 시편 디스크에 고정하도록 합니다.amp실온 또는 4°C에서 10-30분 동안 시편 디스크. 참고: 이것은 시간에 민감한 단계입니다.
2. 버퍼 트레이 또는 트로프의 제자리에 표본 디스크를 고정합니다. 섹션이 있는 아가로스 블록은 면도날과 평행해야 합니다. 샘플이 완전히 잠길 때까지 실온에서 증류수를 버퍼 트레이에 채웁니다.
3. 면도날을 반으로 자른 다음 면도날이 완전히 평평하게 유지되도록 튼튼한 가위로 끝을 자릅니다. 미리 자른 면도날의 절반을 칼 홀더에 부착합니다.
   1. 나이프 홀더의 각도를 84°로, 속도를 0.90mm/sec(진동의 위치 8)로, 주파수를 50Hz(진동의 위치 5)로 설정합니다. 100μm 두께의 단면을 절단합니다. 연속 모드를 사용합니다. 메모: 이 두께는 조직이 일부 염색 프로토콜에 사용되는 다양한 산 및 염기 처리를 견딜 수 있는지 확인하기 위해 선택되었습니다. 단면화를 위한 창을 설정하고 비브라톰이 약 15cm의 아가로스 블록을 절단할 수 있도록 연속 모드에서 20-1.2분을 허용합니다.
4. 버퍼 트레이에서 절단하는 동안 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 섹션을 수집합니다. 또는 버퍼 트레이에서 유리 비커로 섹션을 옮긴 다음 투명한 페트리 플레이트로 옮길 수 있습니다. 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브에 몇 개의 섹션을 옮깁니다. 참고: 표본은 페트리 플레이트에서 수집되는데, 이는 선명한 배경에서 단면을 더 쉽게 볼 수 있고 버퍼 트레이가 다음 표본을 위해 프라이밍될 수 있기 때문입니다.
5. 절편은 50ml 튜브에 보관하거나 4°C에서 30-60분 동안 1.5-2ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집 및 보관할 수 있습니다.
   메모: 섹션을 장기간 보관하면 이미지 품질이 저하됩니다.

3. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) 염색

1. 플로로글루시놀 0.3g을 10ml 앱솔루트 에탄올에 용해시켜 3% 플로로글루시놀 용액을 준비합니다. 한 부피의 농축 HCl(37N)을 에탄올의 3% 플로로글루시놀 두 부피에 혼합합니다. 이 용액은 phloroglucinol-HCl(Ph-HCl) 또는 Wiesner stain.
   입니다. 메모: 이 용액은 염색 당일에 새로 만들어야 하며 시간이 지남에 따라 용액이 분해되고 염색이 효과가 없게 되므로 보관할 수 없습니다.
   주의: HCl은 부식성이 강하므로 Ph-HCl 얼룩을 취급할 때 각별히 주의하십시오.
2. 스템 절편을 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 절편이 들어 있는 튜브에 Ph-HCl 용액 1ml를 넣고 Ph-HCl 염색의 HCl은 부식성이 높기 때문에 즉시 캡을 씌웁니다. 튜브를 부드럽게 움직여 모든 섹션이 얼룩졌는지 확인합니다. 이 단계의 대안은 Ph-HCl 용액을 위아래로 피펫으로 만들 수 있도록 튜브 캡을 열어 두는 것입니다.
   메모: 섹션을 피펫 팁에 피펫으로 넣으면 해당 섹션이 손상될 수 있으므로 주의하십시오.
   1. 단면을 손상 없이 쉽게 피펫으로 빼낼 수 있도록 피펫 팁이 절단된 1ml 피펫을 사용하십시오. 절편을 팁과 현미경 슬라이드에 부드럽게 피펫으로 넣습니다. 커버 슬립으로 섹션을 덮으십시오. 명시야 조명 아래의 섹션을 관찰하십시오. (그림 2)
      메모: Ph-HCl 용액은 5-10분 안에 건조되어 시편이 열화됩니다. 따라서 이미징은 해당 기간 내에 완료되어야 합니다.

결과

그림 1. 줄기를 삽입하기 위한 수제 금형.왼쪽에; 2ml 나사 캡 미세 원심분리기 튜브(파트 A)의 상단과 0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브(파트 B)의 하단. 오른쪽에; 두 부분을 보유하고있는 파라 필름; A와 B를 만들어 최종 금형을 형성합니다.

그림 2. A. thaliana 줄기 단면의 Phloroglucinol-HCl 염색. 야생형 A. thaliana 줄기 절편의 Phloroglucinol-HCl 염색(분홍색 또는 자홍색)은 근막간 섬유 및 물관부 세포(A-E)의 벽에서 정상적인 리그닌 침착을 보여줍니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	엠디(EMD)	MERC2125	CAS 번호 : 9012-36-6
플로로글루시놀	시그마	피 3502	1,3,5-트리하이드록시벤젠 [CAS 번호: 108-73-6]
염산	엠디(EMD)	HX0603-75	CAS 번호: 7647-01-0
에탄올 190 프루프	(주)코프텍	V1401	CAS 번호 : 64-17-5
비브라톰	라이카	라이카 진동 블레이드 마이크로톰 VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ 제품/단면/진동블레이드-마이크로톰/상세/제품/라이카-VT1000-S/
면도기	미국 안전 면도기 회사	항목 # 60-0139-0000	스테인레스 스틸 더블 에지 블레이드 (Personna Super)
스크류 캡 마이크로 원심분리기 튜브(2ml)	폭스바겐	16466-044
마이크로 원심분리기 튜브(0.6ml)	Axygen 사이언티픽	MCT-060-C
티슈 접착제	테드 펠라 Inc	10033	4 °C 또는 20 °C에서 3개월 이상 보관
기계식 셔터가 없는 CCD 칩이 있는 카메라	하마마쓰	C4742-95
카메라 소프트웨어	분자 장치	MetaMorph 버전 7.7.0.0
분석 상상	어도비	포토샵 CS4
마이크로 커버 안경, 사각, No. 1	폭스바겐	제48366-067	22 x 22mm(7/8 x 7/8") 커버 유리는 부식에 강합니다.
불투명 마이크로 슬라이드, 1mm	폭스바겐	48312-003	75 x 25 밀리미터 - 1 밀리미터