리그닌을 위한 Maule 염색: 애기장대 탈리아나 줄기 절편에서 리그닌 분포를 특성화하는 기술

초록

출처: Pradhan Mitra, P. et al., Arabidopsis thaliana 2차 세포벽 요소의 조직화학적 염색. J. Vis. 특급 (2014).

이 비디오에서는 특수 식물 세포에 존재하는 시린질 리그닌을 염색하기 위한 Maule 염색 기술에 대해 설명합니다. 이 염색 기술은 물관부 및 근막간 섬유의 리그닌 분포를 특성화하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 말레 염색

1. 0.2g의 과망간산칼륨을 증류수 40ml에 용해시켜 0.5% 과망간산칼륨 용액을 준비합니다. 어두운 병에 담아 실온에서 최대 7일 동안 보관하십시오.
   1. 증류수 9ml에 1ml의 농축 HCl(37N)을 첨가하여 3.7% HCl 용액을 준비합니다(1:10). 실험 당일에 새로운 3.7% HCl 용액을 준비합니다. 사용 중인 37N HCl 원액이 너무 오래되지 않았는지 확인하십시오. 농축 수산화 암모늄 용액 (14.8 M)은 포화 용액의 몰 농도가 감소하는 것을 방지하기 위해 4 °C에서 보관해야합니다.
2. 스템 절편을 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 0.5% 과망간산칼륨 용액 1ml를 단면이 들어 있는 튜브에 추가합니다.
   1. 0.5% 과망간산칼륨 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하되, 가급적이면 단면을 방해하지 않는 것이 좋습니다. 2분 동안 배양하고 피펫팅을 반복합니다. 모든 섹션이 안정될 때까지 마이크로 원심분리기 튜브를 그대로 두십시오.
      메모: 섹션이 손상될 수 있으므로 섹션을 피펫 팁에 피펫으로 넣지 않도록 주의하십시오. 용액이 어둡기 때문에 줄기 부분을 보기 어려울 수 있으므로 섹션이 있는 튜브를 시험관 랙에 보관하고 2분 동안 가라앉히도록 합니다.
   2. 1ml 피펫을 사용하여 700μl의 0.5% 과망간산칼륨 용액을 추출합니다. 증류수 700μl를 첨가하여 과망간산칼륨 용액을 헹굽니다. 3-4회 또는 물 용액이 맑아질 때까지 반복합니다.
   3. 물을 버리십시오. 섹션에서 짙은 갈색이 배출될 때까지 3% HCl 1ml를 빠르게 첨가합니다. 이것은 3-5분 이내에 발생하거나 각각 5분씩 2회 세탁이 필요할 수 있습니다. 모든 3% HCl 용액을 피펫으로 빼내고 즉시 다음 단계로 진행합니다.
   4. 진한 수산화 암모늄 용액 1ml를 첨가하십시오. 팁이 절단된 1ml 피펫을 사용하여 섹션을 손상 없이 쉽게 피펫으로 빼낼 수 있습니다. 절편을 팁과 현미경 슬라이드에 부드럽게 피펫으로 넣습니다. 커버 슬립으로 섹션을 덮으십시오. 명시야 조명 아래의 섹션을 관찰하십시오. (그림 1)
      주의: 수산화암모늄은 부식성이 매우 높기 때문에 현미경 또는 렌즈의 스테이지에 부식을 일으키지 않도록 각별한 주의와 주의가 필요합니다.
      메모: 수산화암모늄 연기는 커버슬립에 김이 서리게 하여 샘플을 관찰하기 어렵게 만들 수 있습니다. 따라서 커버슬립을 추가하기 전에 각별히 주의하십시오. 용액은 5-10분 안에 건조되므로 해당 시간 내에 이미징을 완료해야 합니다.

결과

그림 1. A. thaliana 줄기 단면의 Mäule 염색. 야생형 A. thaliana 줄기 단면의 Mäule 염색(붉은색)은 근막간 섬유와 물관부 세포(A-E)의 벽에 정상적인 리그닌 침착을 보여줍니다. 표피와 피질(Ep), 근막간 섬유(Fi), 속(Pi) 및 물관부(Xy)의 위치가 표시됩니다. 배율 : 패널 A : 5X; 패널 B : 10X; 패널 C : 20X; 패널 D 및 E: 40X. 막대 = 100μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	엠디(EMD)	MERC2125	CAS 번호 : 9012-36-6
염산	엠디(EMD)	HX0603-75	CAS 번호: 7647-01-0
비브라톰	라이카	라이카 진동 블레이드 마이크로톰 VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ 제품/단면/진동블레이드-마이크로톰/상세/제품/라이카-VT1000-S/
면도기	미국 안전 면도기 회사	항목 # 60-0139-0000	스테인레스 스틸 더블 에지 블레이드 (Personna Super)
스크류 캡 마이크로 원심분리기 튜브(2ml)	폭스바겐	16466-044
마이크로 원심분리기 튜브(0.6ml)	Axygen 사이언티픽	MCT-060-C
티슈 접착제	테드 펠라 Inc	10033	4 °C 또는 20 °C에서 3개월 이상 보관
기계식 셔터가 없는 CCD 칩이 있는 카메라	하마마쓰	C4742-95
카메라 소프트웨어	분자 장치	MetaMorph 버전 7.7.0.0
분석 상상	어도비	포토샵 CS4
마이크로 커버 안경, 사각, No. 1	폭스바겐	제48366-067	22 x 22mm(7/8 x 7/8") 커버 유리는 부식에 강합니다.
불투명 마이크로 슬라이드, 1mm	폭스바겐	48312-003	75 x 25 밀리미터 - 1 밀리미터
수산화암모늄	엠디(EMD)	AX1303-6	CAS 번호: 1336-21-6
과망간산칼륨	시그마	223468	CAS 번호 7722-64-7

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