Calcofluor White staining: 쌍떡잎식물 줄기 절편의 세포벽에 있는 셀룰로오스 침전물의 UV 유도 형광 시각화를 위한 간단한 방법

초록

출처: Pradhan M. et al. Arabidopsis thaliana 2차 세포벽 요소의 조직화학적 염색. J. Vis. 특급 (2014년)

이 비디오에서는 쌍떡잎식물 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 세포벽 내 셀룰로오스 침착을 시각화하는 염색 절차를 설명하며, 이는 β 결합 글루칸에 특이적으로 결합하여 자외선 아래에서 형광을 나타냅니다.

프로토콜

1. 스템 임베딩

1. 물에 7% 아가로스 용액을 만듭니다(증류수 100ml에 전기영동 등급 아가로스 7g). 아가로스를 20분 동안 고압증기멸균하거나 가장 낮은 강도(예: 1,250와트 전자레인지의 10% 강도)에서 20분 동안 전자레인지에 돌려 아가로스를 용해시킵니다.
2. 플라스틱 바이알을 사용하여 줄기를 삽입하기 위한 수제 금형을 준비합니다.
   1. 면도날을 사용하여 2ml 나사 캡 미세 원심 분리기 튜브(파트 A)의 원뿔형 바닥을 잘라냅니다. 주사기 바늘을 사용하여 삽입할 줄기의 직경보다 약간 큰 튜브 캡에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브(파트 B)의 바닥에서 0.5cm 떨어진 곳을 자릅니다.
   2. 0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브의 절단된 0.5cm 부분을 미리 절단된 2ml 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 파라필름을 사용하여 두 부분을 밀봉합니다(그림 1).
      참고: 튜브의 바닥은 아가로스가 응고된 후 포함된 샘플을 쉽게 제거할 수 있도록 절단됩니다. 캡의 구멍은 줄기가 아가로스에 박혀 있을 때 줄기를 안정적으로 유지하는 데 도움이 됩니다. 곰팡이는 아가로스를 고정하고 매립할 때 줄기를 똑바로 유지하는 역할을 합니다. 파라필름은 아가로스가 설정되고 줄기가 삽입될 때까지 A와 B의 두 부분을 유지합니다.
   3. 면도날을 사용하여 관심 영역(예: 첫 번째 줄기 마디의 중간)에서 줄기 부분을 자릅니다.
      참고: 이상적으로는 탈수로 인한 파괴를 방지하기 위해 매립 직전에 줄기를 절단해야 합니다. 또는 스템을 물에 적신 여과지가 들어있는 플레이트에 임시로 보관할 수 있습니다. 이 플레이트는 조직 탈수 및 변형을 방지하기 위해 내장할 준비가 될 때까지 얼음 위에 놓을 수 있습니다. 수분이 많지 않은 상태에서 30분 이상 줄기를 보관하면 줄기가 건조해집니다.
3. 아가로스를 전자레인지에 저강도로 녹입니다.
   주의: 아가로스가 들어 있는 병은 뜨거울 수 있습니다. 장갑을 사용하여 병을 집습니다. 녹인 아가로스를 약 20°C로 식을 때까지 실온(25°C에서 50°C 사이)으로 두십시오.
4. 미리 만들어진 플라스틱 틀에 아가로스 5ml를 천천히 피펫으로 넣어 바이알을 채웁니다.
   알림: 금형에 기포가 없는지 확인하십시오. 기포는 아가로스 주형에 틈을 일으키고 줄기 샘플을 완전히 덮지 않아 결국 샘플 단면의 고르지 않은 절단으로 이어질 것입니다.
   1. 아가로스를 30-60초 동안 식혀 반고체가 되도록 합니다. 작은 이쑤시개로 테스트하여 아가로스에서 침투하고 일어설 수 있지만 뜨지 않는지 확인하십시오.
      참고: 아가로스가 아직 뜨거울 때 줄기를 배치하면 줄기를 쪼그라들어 세포 형태를 파괴하여 샘플을 손상시킬 수 있습니다.
   2. 아가로스로 채워진 이 바이알에 줄기를 넣습니다. 줄기가 똑바로 유지되는지 확인하십시오. 구멍이 뚫린 캡을 스템의 끝이 캡에 고정되도록 놓습니다. 나사식 캡을 돌리지 마십시오. 때로는 하나 이상의 줄기(단일 종류)가 단일 바이알에 내장될 수 있습니다. 그러나 이 특별한 경우에는 cap.
      를 사용하지 마십시오. 알림: 나사식 캡을 돌리면 스템이 꼬입니다.
5. 바이알이 굳을 때까지 10-30분 동안 바이알을 실온 또는 4°C로 두십시오.
6. 튜브에서 부드럽게 밀어 금형을 제거합니다. 파라필름을 엽니다. 엄지 손가락으로 금형의 B 부 바닥을 부드럽게 밀어 A 부의 응고된 아가로스를 유리 현미경 슬라이드로 분리합니다.
7. 아가로스가 박힌 줄기를 길이가 1.2cm인 거의 같은 세 조각으로 자릅니다. 아가로스에 없는 줄기 부분을 잘라내어 버립니다.
   밀폐된
   1. 2ml 마이크로 원심분리기 튜브에 줄기가 박힌 아가로스 조각을 절단할 준비가 될 때까지 4°C의 어두운 상자에 보관하십시오. 또는 튜브를 최대 1주일 동안 4°C에서 보관하십시오.
      참고: 저장은 가능하지만 실험자는 포함된 스템이 여전히 살아 있고 실험에 따라 아티팩트가 잠재적으로 도입될 수 있음을 인식해야 합니다.

2. 스템 단면화

주의: 비브라톰 설명서를 주의 깊게 읽고 모든 안전 지침을 따르십시오.

1. 시편 디스크가 깨끗하고 완전히 건조되었는지 확인하십시오(고체 또는 액체가 없음). 면도날로 표본 디스크를 청소하여 이전 실험에서 잔여 접착제를 제거하고 물로 씻습니다. 그런 다음 종이 타월로 말리십시오.
   참고: 이렇게 하면 접착제가 잘 작동하고 아가로스 표본에 결합됩니다. 이 단계를 제대로 수행하지 않으면 시편이 디스크에 부착되지 않을 수 있으며 나중에 절단 중에 시편이 디스크에서 떨어질 수 있습니다.
   1. 부드러운 종이 물티슈를 사용하여 표본이 들어 있는 아가로스 블록에서 수분을 제거합니다.
   2. 표본 디스크에 조직 접착제를 한 방울 떨어뜨립니다.접착 병의 끝을 사용하여 플레이트 중앙 영역을 덮도록 접착제를 줄무늬 제거. 아가로스 블록을 빠르게 배치하여 표본이 각각 횡단 또는 세로 단면을 위해 플레이트에 수직 또는 평행이 되도록 합니다. 접착제가 실온 또는 4°C에서 10-30분 동안 샘플을 표본 디스크에 고정하도록 합니다.
      참고: 이 단계는 시간에 민감한 단계입니다.
2. 버퍼 트레이 또는 트로프의 제자리에 표본 디스크를 고정합니다. 섹션이 있는 아가로스 블록은 면도날과 평행해야 합니다. 샘플이 완전히 잠길 때까지 실온에서 증류수를 버퍼 트레이에 채웁니다.
3. 면도날을 반으로 자른 다음 면도날이 완전히 평평하게 유지되도록 튼튼한 가위로 끝을 자릅니다. 미리 자른 면도날의 절반을 칼 홀더에 부착합니다.
   1. 나이프 홀더의 각도를 84°로, 속도를 0.90mm/sec(진동의 위치 8)로, 주파수를 50Hz(진동의 위치 5)로 설정합니다. 100μm 두께의 단면을 절단합니다. 연속 모드 사용.
      참고: 이 두께는 조직이 일부 염색 프로토콜에 사용되는 다양한 산 및 염기 처리를 견딜 수 있는지 확인하기 위해 선택되었습니다. 단면화를 위한 창을 설정하고 비브라톰이 약 15cm의 아가로스 블록을 절단할 수 있도록 연속 모드에서 20-1.2분을 허용합니다.
4. 버퍼 트레이에서 절단하는 동안 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 섹션을 수집합니다. 또는 버퍼 트레이에서 유리 비커로 섹션을 옮긴 다음 투명한 페트리 플레이트로 옮길 수 있습니다. 몇 개의 섹션을 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   참고: 표본은 깨끗한 배경에서 섹션을 더 쉽게 볼 수 있고 버퍼 트레이를 다음 표본을 위해 프라이밍할 수 있기 때문에 페트리 플레이트에서 수집합니다.
5. 절편은 50ml 튜브에 보관하거나 4°C에서 30-60분 동안 1.5-2ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집 및 보관할 수 있습니다.
   참고: 섹션을 장기간 보관하면 이미지 품질이 저하됩니다.

3. Calcofluor 백색 염색

1. 0.02g의 형광 증백제 28(calcofluor white M2R)을 10ml 증류수에 용해시켜 0.2% 원액을 준비합니다. 0.2% 용액은 4°C의 어두운 병에 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 0.2% 원액을 증류수로 10배 희석하여 0.02%의 작업 용액을 준비합니다.
2. 스템 절편을 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 0.02% calcofluor white 용액 1ml를 추가합니다. 0.02% calcofluor 백색 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
   알림: 섹션이 손상될 수 있으므로 섹션을 피펫 팁에 피펫으로 넣지 않도록 주의하십시오.
   1. 실온에서 5분 동안 배양하고 피펫팅을 반복합니다. 실온에서 3분 더 배양합니다.
      알림: 섹션을 손상시키지 않고 용액을 더 쉽게 피펫으로 빼낼 수 있도록 섹션이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.
   2. 1ml 피펫을 사용하여 700μl의 0.02% calcofluor 백색 용액을 추출하고 700μl의 증류수를 추가합니다. calcofluor 백색 용액을 헹굴 때까지 5분 동안 기다립니다. 세척을 3-4x 반복합니다. 단면을 손상 없이 쉽게 피펫으로 빼낼 수 있도록 피펫 팁이 절단된 1ml 피펫을 사용하십시오.
   3. 절편을 팁과 현미경 슬라이드에 부드럽게 피펫팅하고 커버슬립으로 덮습니다. 자외선 아래에서 섹션을 관찰하십시오.

결과

그림 1. 줄기를 삽입하기 위한 수제 금형. 왼쪽에; 2ml 나사 캡 미세 원심분리기 튜브(파트 A)의 상단과 0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브(파트 B)의 하단. 오른쪽에; 두 부분을 보유하고있는 파라 필름; A와 B를 만들어 최종 금형을 형성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	엠디(EMD)	MERC2125	CAS 번호 : 9012-36-6
형광증백제 28/ 석회형백색 염색	시그마	F3543	4,4'- 비스 [[4- [비스 (2- 하이드 록시 에틸) 아미노] -6- 아닐리노 -1,3,5- 트리아진 -2- 일] 아미노] 스틸벤 -2,2'- 디술 폰산 [CAS 번호 4404-43-7]
비브라톰	라이카	라이카 진동 블레이드 마이크로톰 VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
면도기	미국 안전 면도기 회사	항목 # 60-0139-0000	스테인레스 스틸 더블 에지 블레이드 (Personna Super)
스크류 캡 마이크로 원심분리기 튜브(2ml)	폭스바겐	16466-044
마이크로 원심분리기 튜브(0.6ml)	Axygen 사이언티픽	MCT-060-C
미트	벨 아트	380000000	SCIENCEWARE 핫 핸드 프로텍터 미트
티슈 접착제	테드 펠라 Inc	10033	4 °C 또는 20 °C에서 3개월 이상 보관
마이크로파	파나소닉	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 즉석 티슈 접착제
마이크로 커버 안경, 사각, No. 1	폭스바겐	제48366-067	22 x 22mm(7/8 x 7/8") 커버 유리는 부식에 강하고 균일하게 두껍고 평평합니다. 1 번 두께는 0.13-0.17 mm입니다.
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