방법 논문

음이온 교환 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 순 전하를 기준으로 투석된 박테리아 용해물에서 관심 단백질을 분리하는 분리 기술

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Fuehner, S., et al. 면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 이온 유도 올리고머의 정제 J. Vis. Exp. (2019년)

이 비디오에서는 대장균 배양에서 얻은 단백질의 순 표면 전하를 기반으로 인간 칼슘 결합 단백질 S100A12를 정제하는 음이온 교환 크로마토그래피 기술을 시연합니다.

프로토콜

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1. 단백질 정제

  1. 음이온 교환 크로마토그래피
    1. 투 석
      1. 20mM Tris, 1mM EDTA 및 1mM 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N, N, N', N'-테트라아세트산(EGTA)을 탈이온수에 용해시켜 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX) 완충액 A를 제조하고 HCl로 pH를 8.5로 조정합니다. 투석의 경우 2 x5 L, 크로마토그래피의 경우 2x 1 L의 AIEX 완충액 A.
        를 준비합니다. 메모: 투석액 부피는 샘플 부피의 약 100배여야 합니다. 크로마토그래피에 사용되는 모든 완충액은 여과(0.45μm 이하)하고 탈기(예: 초음파 수조 또는 진공 탈기)해야 합니다.
      2. 투석 튜브(분자량 한계[MWCO]: 3.5kDa)를 회전하는 교반 막대 위의 시료 부력을 보장하기 위해 공기를 위한 추가 공간이 있는 적절한 길이로 자릅니다.
        메모: 글리세롤은 멤브레인을 보존하므로 사용 전에 제거해야 합니다.
      3. 세척된 단백질 용액의 점도를 줄이려면 용액을 25mL의 AIEX 완충액 A로 희석하여 크로마토그래피 컬럼에 쉽게 적용할 수 있습니다. 첫 번째 마개를 튜브에 부착하고 샘플을 멤브레인에 로드한 다음 두 번째 마개를 튜브 상단 끝에서 최소 1cm 떨어진 곳에 부착합니다.
      4. AIEX 완충액 A가 있는 5L 용기를 교반 플레이트에 놓고 교반 막대와 단백질 용액으로 채워진 멤브레인을 추가합니다. 회전 교반 막대와의 간섭을 피하여 샘플을 회전하도록 속도를 조정합니다. 4°C에서 12-24시간 동안 투석한 다음 투석액 완충액(AIEX 완충액 A)을 새로운 사전 냉각된 제제로 교체하고 최소 4시간 동안 계속합니다. 투석된 단백질 용액을 50mL 튜브로 옮기고 0.45μm 필터 장치를 통해 여과합니다.
        메모: 저장 가능.
    2. 크로마토그래피
      1. 액체 크로마토그래피 시스템(FPLC)을 일반 유지보수로 시작하고 컬럼 버퍼 AIEX A 및 AIEX B(AIEX 버퍼 A, 1M NaCl)와 음이온 교환 수지 함유 컬럼을 연결합니다. 일반적인 크로마토그래피 파라미터는 표 1을 참조하십시오.
        메모: 버퍼, 컬럼 및 FPLC 장비는 실행을 시작하기 전에 동일한 온도로 평형을 이루어야 합니다(표 1, 표 2의 크로마토그래피 파라미터 참조).
      2. AIEX 버퍼 A로 컬럼을 평형화한 후 샘플을 컬럼에 로드하고 0%에서 100% 고염 버퍼(AIEX B)까지의 선형 그래디언트로 단백질을 용리합니다. 자세한 방법 프로토콜은 표 2를 참조하십시오.
      3. 용리 중 2mL 분획을 수집하고 Coomassie 염색 15% 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서 각 분획 10μL를 분석합니다. 투석을 위해 S100A12 단백질을 함유한 분획을 모읍니다.
        메모: S100A12의 분자량은 10,575Da입니다.

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결과

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표 1: 음이온 교환 크로마토그래피의 적용된 파라미터에 대한 자세한 정보.

침대 용적(CV)75 밀리리터
모니터280nM에서 흡광도
압력 최대3 바
열 버퍼 A20mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, pH 8.5
열 버퍼 B20 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8.5
시료 부피...

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
25% 염산  칼 로스  X897.1
4&빼기; 20% Mini-PROTEAN TGX 단백질 젤  바이오라드  4561093
쿠마시 브릴리언트 블루 R250 염색 솔루션  바이오라드  1610438
쿠마시 브릴리언트 블루 R250 염색 솔루션  바이오라드  1610436
EDTA 디소듐 염 이수화물  칼 로스  8043.1
EGTA  칼 로스  3054.3
Q 세파로스 패스트 플로우  GE 헬스케어  위치 17-0510-01  음이온 교환 크로마토그래피용 수지
염화나트륨(NaCl)  칼 로스  3957.2
수산화나트륨  칼 로스  P031.1
트리스 베이스  칼 로스  4855.3
0.45 &마이크로; M 주사기 필터  머크  SLHA033SS
5 L 측정 비커  칼 로스  CKN3.1
50mL 원추형 원심분리기 튜브  코닝  430829
투석 튜브 클로저  스펙트럼  132738
분획 수집기 튜브 5 mL  그라이너  115101
스펙트럼/Por 투석막(3.5 kDa)스펙트럼  132724
스테리톱 필터 유닛  머크  SCGPT01RE
Ä KTA 정수기 UPC 10  GE 헬스케어  FPLC 시스템
분획 수집기  GE 헬스케어  Frac-920
미니 프로티언 테트라 셀  바이오라드  1658000EDU
나노광도계  임플렌  P330
pH 측정기  닉  765

재인쇄 및 허가

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태그

FPLC4

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