방법 논문

칼슘 의존성 소수성 상호작용 크로마토그래피: 소수성 상호작용을 기반으로 칼슘 결합 단백질을 정제하는 기술

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Fuehner, S., et al., 면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 이온 유도 올리고머의 정제. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오에서는 칼슘 의존성 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 통해 투석된 세포 용해물에서 칼슘 결합 단백질을 정제하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 결합 단백질은 칼슘과 결합할 때 소수성 영역을 노출시켜 수지의 소수성 그룹과의 상호 작용을 촉진합니다. 나중에 이러한 단백질은 상호 작용을 역전시키는 칼슘 킬레이트 EDTA를 사용하여 용출됩니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 칼슘 의존성 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)

  1. 투 석
    1. 단백질 용액을 20mM Tris, 140mM NaCl, pH 7.5에 대해 투석합니다
      2. .
  2. 크로마토그래피
    1. 20mM Tris, 140mM NaCl 및 25mM CaCl2를 탈이온수에 용해시켜 크로마토그래피 완충액 HIC A 1L를 준비하고 pH를 7.5로 조정합니다. HIC 완충액 B의 경우 20mM Tris, 140mM NaCl 및 50mM EDTA를 용해합니다. pH를 7.0으로 조정하고 버퍼를 여과 및 탈기합니다. 샘플에 CaCl2를 최종 농도 25mM까지 추가하고 0.45μm를 통해 필터링합니다. HIC 완충액과 시료를 4°C(컬럼 온도)로 평형화합니다.
    2. 일반 유지 보수로 액체 크로마토그래피 시스템을 시작하고 컬럼 버퍼 HIC A 및 B와 컬럼을 연결합니다. 추가 크로마토그래피 파라미터에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
    3. 컬럼을 평형화하고, 샘플을 로드하고, UV 신호가 다시 기준선 수준에 도달할 때까지 'wash unbound sample' 블록을 확장합니다. 그런 다음 칼슘 킬레이터 함유 완충액(EDTA)으로 용리를 시작합니다. 자세한 메소드 프로토콜은 표 2를 참조하십시오.
      메모: 이전 실험에서는 과도한 칼슘이 크로마토그래피 수지에 S100A12 결합하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다.
    4. 2mL의 피크 분획을 수집하고 Coomassie 염색 15% SDS-PAGE에서 각 분획의 10μL를 분석합니다. 순수 S100A12 분획을 풀링하고 Hepes-buffered saline (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0)에 대해 투석합니다.
      메모: 단량체 S100A12의 흡광 계수는 2980 M입니다-1 cm-1.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

표 1: 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 적용된 파라미터에 대한 자세한 정보.

<...
차단음량완충기배출구
평형1−2 컬럼 부피(CV)ᅡ낭비
샘플 로드해당 없음ᅡ낭비
언바운드 샘플 세척1−2 이력서

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
화학
EDTA 디소듐 염 디하이드레이트칼 로스8043.1
페닐 세파로스 고성능GE 헬스케어Tel.: 17-1082-01소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 수지
염화나트륨 (NaCl)칼 로스3957.2
수산화나트륨칼 로스P031.1
트리스 베이스칼 로스4855.3
25% 염산칼 로스X897.1
칼슘클로라이드 Dihydrat칼 로스5239.1
실험기구
0,45μm 주사기 필터머 크SLHA033SS
14 mL 라운드바텀 튜브BD (영어)352059
2 L 삼각 플라스크칼 로스라이98.1
분획 분취기 튜브 5 mL그라이너115101
Spectra/Por 투석 멤브레인 (3.5 kDa)스펙트럼132724
Steritop 필터 장치머 크SCGPT01RE
설비
분획 분취GE 헬스케어프랙-920
기

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

EDTAUV

관련 논문