니켈 친화성 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 박테리아 세포 용해물에서 폴리히스티딘 표지 재조합 단백질을 정제하는 기술

초록

출처: Pokhrel, A. et al. Clostridium difficile의 (p)ppGpp Synthetase에 대한 정제 및 체외 활성 분석. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 클로스트리듐 디피실리 박테리아에서 히스티딘 태그가 지정된 피로포스포키나제 효소를 정제하는 니켈 친화성 크로마토그래피 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. 니켈 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제

1. 중력 컬럼에 니켈-니트릴로아세트산(Ni-NTA) 수지 1mL를 사용하여 단백질을 정제합니다.
   1. 사용 전날, 2mL의 평형 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.79, 300mM NaCl, 50mM NaH₂PO₄, 0.5mg/mL 라이소자임, 5mM MgCl₂, 10mM 이미다졸, 0.25mM DTT, 5mM 페닐메탄 설포닐 플루오라이드(PMSF), 10% 글리세롤)으로 밤새 컬럼을 평형화합니다.
   2. 다음 날 정화된 용해물을 로드하기 전에 컬럼을 4°C에서 RT로 가져오고 ~2–3 h.
      동안 그대로 둡니다. 메모: 컬럼을 열 평형 상태로 가져오는 것은 컬럼 내에 기포가 형성되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
   3. 펠릿을 용해 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.8, 300mM NaCl, 5mM MgCl₂, 50mM NaH_2PO4, 10% 글리세롤, 0.5mg/mL 라이소자임, 10mM 이미다졸, 0.25mM DTT 및 5mM PMSF)에 재현탁합니다.
   4. 8 x 10초 간격으로 얼음 위에서 세포를 초음파 처리하고, 펄스 사이에 30초 동안 일시 중지합니다.
   5. 마이크로 원심분리기를 사용하여 3,080 x g에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 용해물을 정화합니다.
   6. 동일한 부피의 lysis buffer로 lysate를 준비한 다음 준비된 정화 lysate를 column에 적용하고 flow-through를 수집합니다.
   7. 정화된 용해물 유류를 컬럼에 다시 도포하고 2차 유류를 수집합니다.
   8. 세척 버퍼 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM 이미다졸, 10 % 글리세롤)로 컬럼을 세척합니다. flow-through.
      수집 참고: 세척 및 용출 완충액에 5mM MgCl₂를 포함하는 것은 정제된 단백질의 효소 활성에 중요합니다.
   9. 세척 완충액 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄ 및 50 mM 이미다졸)로 컬럼을 세척합니다.
   10. 플로우 스루를 수집합니다.
   11. 2mL 용출 완충액(10mM Tris-HCl(pH 7.79), 300mM NaCl, 50mM NaH_2PO4, 10% 글리세롤 및 75mM 이미다졸)을 도포합니다. 각각 1mL의 두 분획으로 플로우 스루를 수집합니다.
       메모: 이 단계 이후의 컬럼은 다음 정제 분석에서 동일한 단백질을 정제할 경우 4°C의 평형 완충액에 보관할 수 있습니다. 칼럼은 제대로 보관하면 최대 3회까지 사용할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ni-NTA 수지	G 바이오사이언스	786-940/941
Pierce 일회용 중력 컬럼, 10mL	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 투석 장치(MWCO: 20-kD)	스펙트럼	G235033
초음파 프로세서	음향파	가상 시리즈-750
D3024/D3024R 로터가 있는 마이크로 원심분리기	실로젝스