$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마이코박테리아에서 총 비공유 결합 지질 추출(그림 1)
- 고체 매체에서 마이코박테리아 0.2g을 긁어내고 폴리테트라플루오로에틀렌(PTFE) 라이너 나사 캡이 있는 유리관에 추가합니다.클로로포름 5mL와 메탄올 10mL(클로로포름:메탄올, 1:2)로 구성된 용액을 추가합니다.
메모: 유기용제를 사용하는 경우 유리 수용기만 사용해야 합니다. 플라스틱 용기는 허용되지 않습니다. 더욱, 병을 위한 PTFE 강선 나사 모자는 필요합니다.
주의: 클로로포름은 잠재적으로 독성이 있고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 메탄올은 잠재적으로 독성이 있고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에서 사용해야 합니다.
- 튜브를 밤새 계속 저어주어 마이코박테리아 세포 표면에서 비공유 결합 지질을 추출합니다.
메모: 궤도 진탕 플랫폼을 사용할 수 없는 경우, 가능한 한 자주 주기적인 수동 교반으로 지속적인 교반을 대체할 수 있습니다.
- 유리 깔때기를 여과지로 덮고 유기 용제를 여과하여 유리관에 모읍니다.
- 질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 액상을 증발시킵니다. 튜브에 질소 가스를 채우고 뚜껑을 덮고 4 °C에서 보관하십시오 .
메모: 유리 파스퇴르 피펫을 질소 가스 흐름에 연결하여 원하는 튜브를 구체적으로 증발시킵니다. 또한 튜브용 드라이 블록 히터 내부의 튜브를 37°C로 유지하십시오. 용제가 증발하면 튜브를 닫기 전에 튜브에 질소 가스를 채우십시오.
- 세포 파편에 클로로포름:메탄올 용액 15mL(2:1)를 추가합니다. 튜브를 밤새 계속 저어주어 마이코박테리아 세포 표면에서 비공유 결합 지질을 추출합니다.
메모: 궤도 진탕 플랫폼을 사용할 수 없는 경우, 가능한 한 자주 주기적인 수동 교반으로 지속적인 교반을 대체할 수 있습니다.
- 혼합물을 1시간 동안 그대로 두십시오. 파스퇴르 피펫으로 유기 용매를 회수합니다. 유리 깔때기를 여과지로 덮고 유기 용매를 여과하고 이전에 1.3단계에서 사용한 것과 동일한 유리관에 수집합니다. 질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 액상을 증발시킵니다. 튜브에 질소 가스를 채우고 닫은 다음 4°C에서 다시 보관하십시오.
2. 산 메탄분해에 의한 마이콜산 추출(그림 2A)
- PTFE 라이너 나사 캡이 있는 밀폐 유리관에 2-5mL의 에스테르화 용액을 추가합니다. 유리관에 마이코박테리아 바이오매스 0.2g을 추가합니다.
메모: 에스테르화 용액은 메탄올 30mL, 톨루엔 15mL, 황산 1mL를 혼합하여 형성됩니다. 마이코박테리아 세포는 고형 배양에서 채취하거나 마이코박테리아에서 총 비공유 결합 지질을 추출한 후 탈지화된 세포에서도 채취할 수 있습니다(1.6단계에서 여과 후 남은 세포).
주의: 톨루엔은 가연성이며 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 황산은 부식성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에서 사용해야 합니다.
- 볼텍싱으로 내용을 혼합합니다. 혼합물을 80°C의 건조한 수조에 밤새 그대로 두십시오.
- 실온에 도달할 때까지 튜브를 식힌 다음 튜브에 n-헥산 2mL를 추가합니다. 30초 동안 볼텍싱하여 내용물을 혼합하고 두 개의 명확한 단계가 나타날 때까지 튜브가 가라앉도록 합니다.
주의 : n-헥산은 잠재적인 가연성, 자극성, 환경 파괴성 및 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에서 사용해야 합니다.
- n-헥산상에 해당하는 상부상을 회수합니다. 새 튜브로 옮깁니다.
- 2.3단계를 반복합니다. 상부상을 다시 복구하고 2.4단계에서 사용한 것과 동일한 튜브로 옮깁니다.
- 질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 내용물을 증발시킵니다. 튜브에 질소 가스를 채우고 닫은 다음 4°C에서 보관하십시오.
3. 비누화 및 메틸화에 의한 마이콜산 추출(그림 2B)
- 고체 매체에서 마이코박테리아 0.2g을 긁어내고 PTFE 나사 캡이 있는 유리관에 추가합니다.
- 5% 수산화칼륨을 함유한 메탄올-벤젠 용액 2mL(80:20)를 추가합니다. 볼텍싱으로 내용물을 혼합합니다. 혼합물을 100 °C에서 3 시간 동안 가열합니다 .
주의: 벤젠은 가연성, 발암성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에서 사용해야 합니다.
- 튜브를 실온으로 식히십시오. pH = 1을 달성하기 위해 샘플을 산성화하기 위해 20% 황산을 첨가합니다.
- 디에틸 에테르 3mL를 추가합니다. 볼텍싱으로 내용물을 부드럽게 섞습니다.
- 침전을 통해 두 단계가 형성되도록하십시오. 디에틸 에테르 상을 복구하고 새 튜브로 옮깁니다. 세탁 단계를 총 3회 반복합니다.
- 디 에틸 에테르 추출물을 증류수 2mL로 세척하고 디 에틸 에테르에 해당하는 상부를 새 튜브에 옮깁니다. 세탁 단계를 총 3회 반복합니다.
- 디 에틸 에테르 추출물 위에 무수 황산나트륨 2g을 첨가하여 건조시킵니다.
- 서스펜션을 필터링합니다. 질소 가스 플럭스를 사용하여 내용물을 증발시킵니다.
- 메틸화 단계를 수행하려면 3g의 N-니트로소-N-메틸 요소를 45mL의 디에틸 에테르와 9mL의 40% KOH로 형성된 예냉된 용액에 증류수에 용해시킵니다.
주의: N-니트로소-N-메틸우레아는 독성, 자극성, 발암성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에서 사용해야 합니다.
- 상층액(디아조메탄)을 수산화칼륨 펠릿(약 30g)이 들어 있는 얼음으로 냉각된 새 플라스크로 옮깁니다.
메모: 상등액을 즉시 사용하지 않는 경우 -20°C에서 최대 1시간 동안 보관할 수 있습니다.
주의: 수산화칼륨 펠릿은 자극성 및 부식성 물질입니다. 이 재료는 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 디아조메탄은 독성이 강하고 폭발 가능성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 안전 유리와 함께 층류 후드에 사용해야 합니다.
- 3.10단계에서 얻은 디아조메탄을 함유하는 에테르 용액 2mL를 3.8단계에서 얻은 마이콜산을 함유하는 건조된 디에틸 에테르 추출물에 첨가합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 40°C에서 현탁액을 증발시킵니다.튜브에 질소 가스를 채우고 닫은 다음 메틸화 지질을 4°C에서 보관하십시오.
메모: 에테르가 노란색을 잃을 때까지 층류 후드 아래의 에테르 용액에서 디아조메탄을 증발시킵니다.
4. 박막 크로마토그래피(TLC) 분석
- 유리 TLC 챔버를 포화시킵니다. 이렇게하려면 TLC 챔버의 벽 중 하나를 여과지 조각으로 덮고 용매 혼합물로 구성된 이동상과 접촉하도록합니다. 남은 용매 부피를 TLC 챔버 바닥에 놓습니다.
메모: TLC 챔버의 바닥은 이동상의 최소 1cm로 덮여 있어야 합니다. 본 실험에서는 TLC를 개발하기 위해 다양한 이동상을 사용했습니다. 그들은 85mL의 n-헥산과 15mL의 디에틸 에테르로 구성되었습니다. 디클로로 메탄 100mL; 클로로포름 90mL, 메탄올 10mL 및 물 1mL; 클로로포름 30mL, 메탄올 8mL 및 물 1mL; 클로로포름 60mL, 메탄올 35mL 및 물 8mL; 클로로포름 95mL 및 메탄올 5mL; 및 90mL의 석유 에테르(60-80°C)와 10mL의 디에틸 에테르.
메모: 2차원 TLC에서 첫 번째 방향으로 n-hexane:acetone (95:5)를 세 번 사용하고 두 번째 방향으로 toluene:acetone (97:3)을 사용하여 mycolic acid 조성을 분석합니다. PIM을 분석하려면 첫 번째 방향으로 chloroform:methanol:water (60:30:6)를 한 번 사용하고 두 번째 방향으로 chloroform:acetic acid:methanol:water (40:25:3:6)를 사용합니다. PDIM 및 AG를 분석하려면 첫 번째 방향으로 석유 에테르(60-80 °C):에틸 아세테이트(98:2)를 세 번 사용하고 두 번째 방향으로 석유 에테르(60-80 °C):아세톤(98:2)으로 단일 현상을 사용합니다.
주의: 디에틸 에테르는 잠재적으로 독성이 있고 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 디클로로메탄은 잠재적으로 독성이 있고 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 석유 에테르는 잠재적인 가연성, 환경 파괴성 및 극도로 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 아세트산은 잠재적인 가연성 및 부식성 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 에틸 아세테이트는 가연성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 아세톤은 가연성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에서 사용해야 합니다.
- TLC 챔버를 닫아 최소 20분 동안 포화시킵니다. 한편, 유리관에 존재하는 지질을 0.2-1mL의 chloroform.
에 용해시킵니다.
메모: 지질을 용해하는 데 사용되는 부피는 샘플의 원하는 농도 또는 예상되는 농도에 따라 수정할 수 있습니다.
- 모세관 유리관을 사용하여 각 현탁액 10μL를 TLC 플레이트에 직접 적용하고 실온에서 샘플을 5분 동안 건조시킵니다.
메모: 샘플은 플레이트의 바닥 부분에 적용해야하며 각면에 1cm를 남겨두고 적용해야합니다. 샘플은 서로 최소 0.5cm 이상 분리되어야 합니다. 샘플이 플레이트에 적용되면 튜브를 질소 가스로 다시 증발시키고 추가 사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 이동상을 포함하는 포화 TLC 챔버에 플레이트를 삽입합니다. 모바일 단계가 TLC.
를 통해 실행되도록 허용합니다.
메모: TLC 챔버에 가해지는 모든 움직임은 플레이트에서 작동하는 용매에 영향을 미치고 지질 이동성에 영향을 미칩니다. 2차원 TLC를 수행하는 경우, 두 개의 TLC 챔버가 모두 용출 시스템을 모두 포함해야 합니다.
- 용매가 플레이트 상단에서 1cm 거리에 도달하면 TLC 챔버에서 플레이트를 제거합니다. 실리카가 완전히 건조될 때까지 플레이트를 층류 아래에 두십시오.
메모: n-헥산과 디에틸-에테르(85:15)를 사용하여 마이콜산 조성을 분석하는 경우 TLC 플레이트에서 이동상을 세 번 실행할 때까지 4.4 및 4.5 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 필요한 얼룩이 있는 플레이트를 드러냅니다. 필요한 경우 플레이트를 가열합니다.
메모: 본 실험에서는 15-20 mL의 용액을 사용하여 TLC 플레이트를 분무했습니다 : 플레이트가 밝은 노란색이 될 때까지 에탄올에 10 % 몰리브다토 인산 수화물을 첨가 한 다음 플레이트를 120 °C에서 가열합니다. 황산에 20 % α- 나프톨의 에탄올에 5 % 다음 120 °C에서 플레이트를 가열합니다. 인산염 띠가 나타날 때까지 몰리브덴 블루 시약(4.2M 황산에 1.3% 몰리브덴 산화물) 또는 황산에 1% 안트론이 나타날 때까지.
주의: 몰리브다토인산 수화물은 가연성 및 부식성 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 에탄올은 잠재적인 가연성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의 : 1-나프톨은 가연성, 부식성 및 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에 사용해야 합니다.
주의: 몰리브덴 블루 스프레이 시약은 부식성, 독성 및 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용하고 층류 후드에서 사용해야 합니다.
