헤파린 친화성 크로마토그래피 기반 바큘로바이러스 정제: 곤충 세포 상등액에서 바큘로바이러스를 분리하는 기술

초록

출처: Nasimuzzaman, M. et al., 유전자 치료 응용을 위한 바큘로바이러스의 생산 및 정제. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 헤파린 친화성 크로마토그래피를 사용하여 곤충 세포 상층액에서 바큘로바이러스를 분리하는 기술을 시연합니다. 분리는 컬럼의 헤파린과 바큘로바이러스 외피 당단백질 사이의 친화력에 의해 촉진됩니다.

프로토콜

1. 크로마토그래피 시스템 준비

1. 50mL/분의 선형 유속으로 시료와 완충액을 각각 멸균수, 1N 수산화나트륨, 물 및 세척 완충액(150mM 염화나트륨을 함유한 20mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0)으로 각각 시료와 완충액을 순차적으로 헹궈 크로마토그래피 시스템을 준비합니다.
2. 헤파린 50μm 컬럼(10 × 10cm, 7.9mL의 컬럼 부피(CV))을 7mL/분의 선형 유속으로 컬럼 세척 버퍼(2M 염화나트륨을 함유하는 5CV 멸균 20mM 인산나트륨 버퍼)와 5CV 세척 버퍼를 순차적으로 실행하여 준비합니다.

2. 바큘로바이러스 벡터의 정제

1. 크로마토그래피 시스템을 다음과 같이 설정합니다.
   1. 샘플 로딩 주입구 포트를 사용하여 baculovirus 상층액을 로딩합니다.
   2. 버퍼 입구 포트 A1을 사용하여 세척 버퍼를 로드합니다. 최소 500mL의 세척 버퍼가 있는 병을 준비하고 세척 버퍼 라인을 병에 넣습니다.
   3. 버퍼 입구 포트 A2를 사용하여 용리 완충액(1.5M 염화나트륨이 포함된 20mM 인산나트륨, pH 8.0)을 로드합니다. 최소 500mL의 용리 완충액이 있는 병을 준비하고 용출 완충액 라인을 병에 넣습니다.
   4. 여러 개의 50mL 코니컬 튜브를 분획 분취기에 삽입하여 컬럼 통과 바큘로바이러스 상등액, 세척 완충액 및 용리된 바큘로바이러스를 수집합니다.
2. 7.9mL 컬럼 부피(CV) 5개(CV)의 세척 버퍼(40mL)로 헤파린 컬럼을 7.0mL/분의 선형 유속으로 평형을 이룹니다.
3. 크로마토그래피 시스템의 샘플 펌프(주입구 샘플 포트)를 사용하여 2.0mL/분의 선형 유속으로 250mL의 바큘로바이러스 상등액을 헤파린 컬럼에 로드합니다.
4. 자외선(UV) 흡광도 곡선(280nm)이 기준선으로 복귀하고 안정될 때까지 2.0mL/분의 선형 유속으로 헤파린 컬럼을 통해 10CV(80mL)의 세척 버퍼를 실행합니다.
5. 4.0mL/분의 선형 유속으로 5CV(40mL)의 용리 완충액으로 7.9mL 헤파린 컬럼의 바큘로바이러스 입자를 용리합니다. 바큘로바이러스 입자가 헤파린 컬럼에서 해리될 때 크로마토그램에서 단백질의 날카로운 용리 피크를 관찰합니다.
6. 용리 후, 후속 원심분리 시 삼투압 충격으로 인한 바큘로바이러스 입자의 비활성화를 방지하기 위해 20mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 용출된 바큘로바이러스 상등액을 즉시 10배 희석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
악타 아반트 150	GE 헬스케어	28976337	크로마토그래피 시스템
POROS Heparin 50μm 컬럼	써모피셔 사이언티픽	4333414	헤파린 컬럼
세척 버퍼	사내	카탈로그가 아닌 항목	150mmol/L 염화나트륨을 함유한 20mmol/L 인산염 완충액
용리 버퍼	사내	카탈로그가 아닌 항목	1.5 mol/l 염화나트륨을 함유한 20mmol/l 인산염 완충액
50ml 원뿔형 튜브	써모피셔 사이언티픽	14-959-49ᅡ	Baculovirus 상등액 수집용
컬럼 세척 버퍼	사내	카탈로그가 아닌 항목	2.0 mol/l 염화나트륨을 함유한 20mmol/l 인산염 완충액
멸균수	사내	카탈로그가 아닌 항목	Akta Avant 청소용
수산화나트륨	시그마-알드리치	1.09137	Akta Avant 청소용