양이온 교환 크로마토그래피: 순 표면 전하를 기준으로 곤충 세포 용해물에서 표적 재조합 단백질을 분리하는 기술

초록

출처: Agamasu, C. et al. 완전히 처리된 재조합 KRAS4b: 파르네실화 및 메틸화 단백질의 분리 및 특성화. J. Vis. 특급 (2020년)

이 동영상은 곤충 세포 단백질 용해물에서 재조합 단백질을 분리하는 양이온 교환 크로마토그래피 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. 단백질 정제

1. 표 1과 같이 버퍼 A–H를 준비합니다.

(영문) 명 개 개 명 분 개 개 명 명 개 개 정보 조 명 개 개 정보 조 개 개 정보 조 개 개 개 정보 조 년 개 개 명 개 개

완충 용액	버퍼링제(모두 20mM)	산도	염화나트륨(mM)	이미다졸(mM)	재질 보기 MgCl2	TCEP
ᅡ	헤페스	7.3	300	-	5	1
비	헤페스	7.3	300	35	5	1
씨	헤페스	7.3	300	500	5	1
디	MES	6.0	200	-	5	1
E	MES	6.0	-	-	5	1
에프	MES	6.0	100	-	5	1
지	MES	6.0	1000	-	5	1
H	헤페스	7.3	300	-	1	1

1. 정제 물질 준비(재료 표 참조): EDTA 또는 기타 킬레이트제가 없는 프로테아제 억제제 칵테일, 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 컬럼, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 컬럼, 0.45μm 실린지 필터, 2M 이미다졸(pH = 7.5), 100,000 x g의 초원심분리기, 4,000 x g의 고속 탁상형 원심분리기; 원심 필터 장치(10KDa NMWL); 280nm에서 읽을 수 있는 분광 광도계; His6-담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제; 두 개의 완충액을 혼합하고, 용액을 컬럼에 적용하고, 컬럼에서 그래디언트 용리액을 생성하고, 컬럼에서 분획을 수집할 수 있는 크로마토그래피 기기.
2. 투석과 원심분리에서 곤충 세포 용해물을 4,000 x g에서 10분 동안 제거하여 침전물을 제거합니다. 이 시점에서 최종 투석 및 정화된 샘플은 여전히 흐릿한 경우가 많지만 추가 처리 없이 후속 CEX 컬럼에 적용할 수 있습니다.
3. 3개의 CV로 세척한 다음 3개의 CV로 Buffer F.
   로 세척하여 20mL 양이온 교환 컬럼(재료 표 참조)을 준비합니다. 메모: 다른 수지를 꼼꼼하게 평가하지는 않았지만 여러 동료들이 SP Sepharose 고성능 수지 이외의 수지에서 분리능이 좋지 않다는 것을 발견했습니다.
4. 20mL의 Buffer E를 첨가하여 투석된 샘플 20mL를 최종 NaCl 농도 100mM로 희석하고 희석된 샘플을 양이온 교환 컬럼에 적용합니다.
5. 이전 희석이 하중이 거의 끝나갈 때 위에서 설명한 대로 준비된 새로 희석된 샘플을 로드 튜브에 추가하여 컬럼을 계속 로드합니다.
   메모: 전체 샘플을 한 번에 100mM NaCl로 희석하면 침전으로 인해 표적 단백질이 크게 손실됩니다.
6. 버퍼 F를 사용하여 컬럼을 베이스라인 Abs280으로 세척합니다. 이를 위해서는 일반적으로 3개의 CV가 필요합니다. 단백질은 Buffer F에서 65% Buffer G까지 400mL(20CV) 그래디언트 동안 컬럼에서 용리되어 6mL 분획으로 수집됩니다(그림 1B).
7. 그래디언트가 완료되면 추가로 1.5 CV(65% Buffer G)를 위해 컬럼을 계속 세척합니다.

결과

그림 1: 정제 공정의 SDS-PAGE 겔. (A) 용해물에서 IMAC 캡처. FNTA/B는 ~48kDa로 이동하는 어두운 대역이고 His6-MBP-tev-KRAS4b는 ~67kDa로 이동하는 어두운 대역입니다. M = 단백질 분자량 사다리; T = 총 단백질; L = 정화된 용해물/컬럼 부하; F = 열 흐름. 분획은 증가하는 이미다졸 농도 구배로 용리됩니다. (B) 1–5로 표시된 CEX 분획은 용리 피크의 피크 분획에 해당합니다. (C) TEV 분해 및 두 번째 IMAC. C = CEX 단계 pre-TEV 분열의 풀; L = TEV 절단 후 샘플 로드. 관심 종에 레이블이 지정됩니다. (D) 최종 KRAS4b-FMe 단백질 1 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.8 mL Safe-Lock 튜브, 천연	에펜도르프	22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert 오토샘플러 바이알	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	30211SS-1232
5427R 원심분리기	에펜도르
아세토니트릴, HPLC 등급	피셔 케미컬	A998-1 1L
양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 컬럼	GE 헬스케어 생명과학	29018183	HiPrep SP 세파로스 고성능
Exactive Plus EMR 질량분석기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific
Gilson 바이알 7x14mm 튜브	GE 헬스케어	BR-1002-12
고속/탁상형 원심분리기	Thermo Fischer Scientific	05-112-114일	최대 4,000xg 지원 가능
His6-담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제	애드진	92414	Raran-Kurussi et al. (2017) TEV Protease를 사용한 친화성 태그 제거에 따라 정제되었습니다. 에서: Burgess Brown N. (eds) E.coli의 이종 유전자 발현. 분자 생물학의 방법, vol 1586. Humana Press, 뉴욕, 뉴욕
프로테아제 억제제 EDTA 또는 기타 킬레이터가 없는 칵테일	밀리포어 시그마	P8849
암모늄 아세테이트	시그마-알드리치	09689-250지
아르곤 가스	에어가스	아럽
포름산	시그마-알드리치	F0507-500MI	시약 등급 이상을 사용하십시오.
NGC 크로마토그래피 시스템	바이오라드	78880002	NGC QuestTM 100 크로마토그래피 시스템
홀더가 있는 지질 압출기 세트	AVANTI 극성 지질	610023
액체 질소	에어가스	니-듀어
울트라 15 원심 필터 장치, 10K NMWL	밀리포어 시그마	UFC901008	PES 멤브레인
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5mL 원심분리기 필터	아미콘	UFC501024
초원심분리기	벡크만 쿨터	옵티마 - L80K	100,000 XG 가능
챕 스	시그마	C3023