Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

초록

출처: Collins, S. M., et al., 박테리아 외막 소포 이질성을 분석하기 위한 크기 배제 크로마토그래피. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 박테리아에서 유래한 외막 소포 또는 OMV의 이질적인 집단을 분리하는 기술(크기 배제 크로마토그래피)을 시연합니다. 이러한 소포는 나노 크기의 구형 구조이며 크기 배제 크로마토그래피를 통해 크기에 따라 크고 작은 하위 모집단으로 분리됩니다.

프로토콜

1. 버퍼 준비

1. ELISA 세척 완충액을 준비하려면 탈이온수(DI) 3.94L에 트리스 염기 3.94g, NaCl 8.77g 및 소 혈청 알부민(BSA) 1g을 추가합니다. 500μL 폴리소르베이트-20을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
2. 블로킹 버퍼를 준비하려면 트리스 염기 3.94g, NaCl 8.77g 및 BSA 10g을 추가합니다. 500μL 폴리소르베이트-20을 1L의 DI 워터에 첨가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
3. 용출 완충액(PBS)을 준비하기 위해 8.01g NaCl, 2.7g KCl, 1.42g_Na2HPO4 및 0.24g KH_2PO4를 1L DI water에 첨가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
   메모: 이 완충액의 10x 용액을 만들고 필요에 따라 DI 물로 희석할 수 있습니다.

2. OMV 샘플 준비

1. A. actinomycetemcomitans 세포를 후기 지수 단계(600nm에서 광학 밀도 0.7)까지 성장시킵니다. 10,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 두 번 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 0.45μm 필터를 통해 상층액을 여과합니다.
2. 50kDa-분자량 컷오프 필터를 사용하여 박테리아가 없는 상등액을 농축합니다. 농축 용액을 105,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 초원심분리합니다.
3. 펠릿을 PBS에 재현탁시키고 초원심분리기를 다시 사용합니다(105,000 x g, 4°C에서 30분 동안 사용). 펠릿을 PBS 2mL에 재현탁합니다.

3. S-1000 컬럼 패킹

1. 겔 여과 매체의 기본 병을 유리 교반 막대와 혼합하고 유리병에 컬럼을 채우는 데 필요한 부피와 약 50%의 초과분(약 135mL)을 붓습니다. 이 구슬이 가라앉을 때까지 그대로 두었다가 과도한 액체를 빼냅니다. 비드를 용리 완충액에 재현탁시켜 최종 용액이 약 70%(부피 기준) 겔, 30% 완충액이 되도록 합니다. 진공 상태에서 용액의 가스를 제거하십시오.
2. 링 스탠드를 사용하여 유리 컬럼을 수직으로 장착하고 용리 버퍼를 채워 컬럼 벽을 적십니다. 컬럼에 약 1cm의 버퍼만 남을 때까지 버퍼를 방전합니다.
3. 거품을 만들지 않고 조심스럽게 피펫 구슬을 기둥에 넣고 기둥을 맨 위로 채웁니다. 이 프로세스 전체에서 초과 버퍼를 계속 소모합니다. 컬럼 상단에 비드를 추가하기 전에 비드가 완전히 가라앉지 않도록 하십시오. 컬럼은 컬럼 저장소 바닥에서 약 2cm 아래 높이로 포장해야 합니다.

4. 샘플 로딩 및 분획 수집

1. 진공 상태에서 용리 완충액을 가스를 제거합니다. 두 개의 컬럼 부피(180mL)의 용리 완충액으로 컬럼을 세척합니다.
2. 나머지 버퍼가 열에 완전히 들어갈 수 있도록 합니다. 완충액이 겔 층의 상단에 도달하면, 컬럼 상단의 비드를 방해하지 않도록 주의하면서 OMV(약 100 - 200 nmol/L의 지질 농도)가 포함된 2mL 샘플을 비드 표면에 조심스럽게 피펫팅합니다. 샘플이 겔에 완전히 들어가도록, 즉 겔 층 위에 액체가 남아 있지 않을 때.
3. 겔 컬럼 위에 용리 완충액을 조심스럽게 천천히 추가합니다. 젤의 최상층을 방해하지 마십시오.amp르 희석
.
4. 컬럼 아래에 단일 50mL 튜브를 놓고 컬럼을 엽니다. 용리액의 처음 20mL를 수집합니다. 컬럼이 건조되지 않도록 필요에 따라 조심스럽게 컬럼 상단에 추가 용리 버퍼를 추가합니다.
5. 컬럼 아래에 일련의 1.5mL 튜브를 놓습니다. 컬럼을 시작하고 각 튜브에서 일련의 1mL 샘플을 수집합니다. 샘플을 채취하는 동안 필요에 따라 컬럼 상단에 용리 완충액을 계속 추가합니다. 96개의 분수가 수집될 때까지 반복합니다. 열을 중지합니다.
   메모: 샘플은 추가 분석이 있을 때까지 장기 보관의 경우 -20°C, 단기 보관의 경우 4°C에서 보관해야 합니다.
6. 컬럼을 세척하려면 컬럼을 통해 0.1M NaOH의 컬럼 부피 1개(90mL)를 실행합니다. 컬럼을 통해 두 개의 컬럼 부피(180mL)의 용리 버퍼를 실행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amicon 50 kDa 필터	밀리포어 시그마	UFC905024
FM 4-64	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	T13320	1.5 x 50cm
유리 이코노 컬럼	바이오라드	7371552
염화칼륨(KCl)	암레스코 (VWR)	0395-500지
인산칼륨 일염기성 무수(KH2PO4)	암레스코 (VWR)	0781-500지
세포크릴 S-1000 슈퍼파인	GE 헬스케어	Tel.: 17-0476-01
염화나트륨(NaCl)	피셔 케미컬	시즌 271-3
인산나트륨 이염기성 무수(Na2HPO4)	암레스코 (VWR)	0404-500지
트리스 베이스	폭스바겐	0497-1KG