Butyl-Dedependent Hydrophobic Interaction Liquid Chromatography: 소수성 상호작용을 기반으로 항체-약물 접합체를 특성화하는 기법

초록

출처: Oller-Salvia, B. 빠른 생체 직교 반응을 통한 항체-약물 접합체 생성을 위한 비표준 아미노산의 유전적 암호화. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 항체-약물 접합체의 소수성 상호 작용 액체 크로마토그래피 기반 특성화를 보여줍니다. 부틸 리간드 기반 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 항체-약물 접합체는 리간드와의 소수성 상호 작용을 통해 특성화됩니다.

프로토콜

1. 항체 생산 및 특성화

1. 항체 발현
   1. 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 100 μg/mL 및 250 ng/mL 암포테리신 B가 보충된 50 mL 발현 배지가 들어 있는 250 mL 플라스크에서 HEK 현탁 세포 바이알을 해동합니다. 125 rpm의 쉐이커가 장착된 가습 인큐베이터에서 세포를 8% CO₂로 37 °C로 유지합니다. transfection하기 전에 세포를 0.3-0.5 x 10⁶ cells/mL(2-3일마다)로 최소 2회 분할합니다.
   2. 2.5 x 10⁶ cells/mL의 밀도에 도달하면(분할 후 2-3일) 100mM CypK의 새 용액을 준비합니다. 이를 위해 CypK 64mg의 무게를 측정하고 0.1 수산화나트륨 2.5mL를 첨가하고 와류를 넣고 스핀 다운하여 모든 용해되지 않은 입자를 회수하고 초음파 처리합니다.
   3. 항생제가 보충된 42.5mL의 발현 배지에 2.5mL의 CypK(0.1M NaOH에서 100mM)를 추가합니다. 잘 섞어 0.1M HCl 250μL를 첨가한 후 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
   4. 50μg의 HC 및 LC pKym1 플라스미드를 감소된 혈청 배지로 2.5mL로 희석합니다. 별도의 튜브에서 135μL의 transfection 시약을 감소된 혈청 배지를 사용하여 2.5mL로 희석합니다.
   5. 용액을 준비한 후 5분 후에 플라스미드와 형질주입 시약 용액을 혼합하고 20분 동안 배양하여 DNA와 형질주입 시약 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 합니다.
   6. 그 동안, 500 x g에서 5분 동안 목표 밀도에서 1억 2,500만 개의 세포를 원심분리하고, CypK를 함유한 발현 배지로 재현탁하고, DNA-형질주입 시약 혼합물을 첨가합니다. CypK는 이전에 보고된 대로 구매하거나 합성할 수 있습니다.
   7. 세포를 20시간 동안 배양한 후 키트에 포함된 250μL의 transfection 시약 enhancer를 추가합니다.
   8. CypK 첨가 후 6-7일 후에 상등액에서 항체를 수확합니다(발현 중 배지 변경이 필요하지 않음).
      *대안적으로, 더 높고 더 일관된 수율을 얻기 위해 Oller-Salvia et al. 2018에 설명된 대로 안정적인 세포주를 생성할 수 있습니다. 이 경우, trastuzumab(CypK)₂는 발현 배지에 CypK 5 mM을 첨가하여 간단하게 발현됩니다.
2. 항체를 정제하십시오
   1. 3000 x g에서 15분 동안 세포를 원심분리합니다.
   2. 0.45 또는 0.22 μm 필터로 상층액을 여과합니다. 필터가 가려지면 새 필터로 교체하고 필터링을 계속합니다. 몇 밀리리터 후에도 이런 일이 발생하면 7000 x g에서 15분 동안 상층액을 추가로 원심분리합니다.
   3. 빈 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼에 단백질 A 수지(2mL/상층액 100mL)를 추가하고 최소 5부피의 비드 세척 완충액(0.1M 인산나트륨, 150mM NaCl)으로 수지를 평형화합니다.
   4. 상등액을 두 개의 50mL 코니컬 튜브로 분리하고 5x 비드 세척 버퍼(0.5M 인산나트륨, 150mM NaCl)를 추가한 다음 사전 평형화된 단백질 A 수지를 추가합니다. 원추형 튜브를 실온에서 3시간 동안 롤러에 올려 놓고 상층액의 항체를 끌어내립니다.
   5. 대안적으로: 권장 부피의 두 배 이상의 수지로 컬럼에 상층액을 추가하고 통과하도록 합니다. SDS-PAGE에 의해 상층액에 상당한 양의 항체가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 있는 경우 레진을 통해 상등액을 다시 한 번 용리합니다.
   6. 상등액이 있는 단백질 A 수지를 컬럼으로 옮기고 액체가 통과할 수 있도록 합니다.
   7. 25mL의 세척 버퍼(또는 최소 10개의 레진 부피)를 추가하고 통과시키십시오.
   1mL의
   8. 1M 인산염 완충액, 150mM NaCl에 4mL의 0.1M 구연산나트륨, pH 3으로 항체를 용리합니다.
   9. 항체를 PBS 10mL로 희석하고 원심 여과로 0.5-1mL로 농축한 후 PBS로 완충액을 3회 교환합니다.
   10. FPLC로 0.5mL/분의 흐름과 0-100% 그래디언트를 사용하여 고염 완충액(1.5M(NH4)₂SO₄, 50mM 인산나트륨 pH 7.0, 5% 이소프로판올)에서 저염 완충액(50mM sodium phosphate pH 7.0, 5% 이소프로판올)을 30분 동안 사용합니다. 모든 분획을 수집하고 280nm에서 용리를 모니터링합니다. 소량(< 1 mg)을 수율과 순도를 최대화하기 위해 2.4에 설명된 조건에서 HPLC-HIC로 정제할 수 있습니다.
   11. 항체가 포함된 분획을 풀링하여 PBS로 최소 4mL로 희석하고 원심 여과로 농축하고 PBS로 완충액을 3회 교환합니다.
3. 항체 정량화
   1. 마이크로 볼륨 분광 광도계를 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 대략적인 농도를 얻습니다.
   2. 정확한 측정이 필요한 경우 ELISA 키트를 사용하여 인간 IgG를 측정하십시오. 대략적인 추정치를 위해 다음과 같이 Coomassie 기반 염색과 함께 SDS-PAGE를 사용하십시오.
      1. ELISA로 정량한 트라스투주맙 표준물질을 1mg/mL로 6배 2배 희석하여 표준물질을 준비합니다.
      2. 표준물질과 샘플을 약 0.25mg/mL로 끓여서 로딩 버퍼를 줄입니다.
      3. MES-SDS 완충액을 사용하여 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE에서 실행하고 Coomassie 기반 염료로 염색합니다. 마지막으로 ImageJ를 사용하여 광 사슬 또는 중쇄에 해당하는 대역의 색상 밀도를 측정하고 표준 곡선에서 샘플의 신호를 보간합니다.
4. 항체를 4°C에서 보관하십시오.

2. 항체를 접합하고 ADC를 특성화합니다.

1. 항체를 테트라진 함유 분자와 접합
   1. 작은 원뿔형 튜브(예: PCR 튜브)에서 20μL의 아세토니트릴과 76μL의 PBS로 10몰 당량의 테트라진-vcMMAE(디메틸설폭사이드(DMSO)의 3.4mM)를 희석합니다.
   2. trastuzumab(CypK)₂ (PBS에서 100 μL, 2 mg/mL)의 1몰 당량을 추가하고 철저히 혼합한 후 실온(25 °C)에서 3시간 동안 반응시켜 trastuzumab(MMAE)₂.
      를 형성합니다. 메모: 이 프로토콜을 사용하여 tetrazine-vcMMAE 대신 tetrazine-5-TAMRA와 같은 다른 분자를 항체에 연결할 수 있습니다.
2. ADC 정제
   1. 제조업체의 지침에 따라 크기 제외 스핀 컬럼을 PBS로 사전 평형화합니다.
   2. 스핀 컬럼에 반응의 전체 부피를 추가하고 1500 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
3. ADC를 정량화하고 SDS-PAGE로 켤레를 분석합니다.
   1. 1.3.2에 설명된 대로 ADC를 정량화합니다. 표준 곡선에 대한 비수정 항체를 사용하여 SDS-PAGE에서 경쇄의 색상 밀도를 측정합니다.
   2. 중쇄는 접합 시 분자량의 증가를 보여주며 약간 이동해야 합니다.
      참고: 항체가 trastuzumab(TAMRA)₂와 같은 형광단으로 변형된 경우, 중쇄에 해당하는 밴드만 염색 전에 겔 내 형광을 나타내야 합니다.
4. HPLC-HIC에 의한 접합체 분석
   1. HPLC-HIC 컬럼을 100% 버퍼 A(1.5M(NH₄)₂SO₄, 50mM 인산나트륨 pH 7.0, 5% 이소프로판올)로 5분 동안 평형을 이룹니다.
   2. 15μL(67pmol)의 1mg/mL trastuzumab(CypK)2 용액과 15μL의 2x buffer A를 바이알에 혼합합니다. 그런 다음 HPLC에 10μL 주입을 프로그래밍합니다.
   3. 100% 완충액 A를 사용하여 1분 동안 등용매 1mL/분 흐름으로 용리한 후 B에서 완충액 A의 100%에서 0%(50mM 인산나트륨 pH 7.0, 20% 이소프로판올 20%)에서 15분 동안 그래디언트합니다. 280nm에서 용리를 모니터링합니다.
   4. 각 종에 해당하는 피크를 적분하고 결과 면적을 다음 방정식에 사용하여 DAR을 계산합니다.
      DAR = (1x 트라스투주맙(MMAE) + 2x 트라스투주맙(MMAE)₂)
      /(트라스투주맙(MMAE)₀ + 트라스투주맙(MMAE)₁ + 트라스투주맙(MMAE)₂)
      trastuzumab(CypK)₂의 예상 머무름 시간은 7.5-8.0분, trastuzumab(CypK, MMAE)의 경우 9.1-9.6분, trastuzumab(MMAE)₂의 예상 머무름 시간은 10.5-11.0분입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
엑스피293F	써모피셔 사이언티픽	A14527 (영문	HEK 현탁 세포
Expi293 발현 매체	써모피셔 사이언티픽	A1435101	표현 매체
항생제-항진균제	써모피셔 사이언티픽	15240062	페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B
125mL 폴리 카보네이트 삼각 플라스크 (벤트 캡 포함	코 닝	431143	플라스크를 흔듭
브런즈윅 S41i 인큐베이터	에펜도르프	S41I230011	셰이커가 있는 CO2 인큐베이터
수산화나트륨 4 mol/l (4 N) 수용액	폭스바겐	191373엠
사이클로프로펜 라이신	시켐	사우스 캐롤라이나-8017	이 연구에서는 Elliot et al. 2014에 의해 설명된 대로 합성되었습니다
Steriflip-GP, 0.22 μm, 폴리에테르설폰, 감마 조사	머크 밀리포어	SCGP00525
Opti-MEM, 리즈드 세럼 미디엄	써모피셔 사이언티픽	31985070	감소된 혈청 배지
ExpiFectamine 293 형질주입 키트	써모피셔 사이언티픽	A14525	트랜스펙션(Transfection) 시약
5810 R 원심분리기	에펜도르프	5811000460
Millex-GP 주사기 필터 장치, 0.22 μm, 폴리에테르설폰, 33 mm, 감마 멸균	머크 밀리포어	SLGP033RS
단백질 A 수지	중국 생물학	10600-P07E-RN-25
Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼, 50개 패키지	바이오 라드	7311550	폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼
Econo-Column 퍼널	바이오 라드	7310003
구연산나트륨	플루카	71635
ÄKTA 탐색기 FPLC	GE 헬스케어
HiTrap HIC 선택 키트	GE 헬스케어	Tel.: 28-4110-07	HiTrap 1mL 부틸 HP 포함
황산 암모늄	폭스바겐	2133.296
이소프로파놀	호니웰	34863-2.5엘
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치	D8418-50ML
테트라진-vcMMAE	켐파트너	-	코스툼 합성
테트라진-5-TAMRA	예나 바이오사이언스	CLK-017-05
NuPAGE 4-12% 비스트리스 젤 1.0mm x 10	써모피셔사이언티픽	NP0321BOX
Xcell SureLock 미니 셀	써모피셔사이언티픽	EI0001
얼티메이트 3000 HPLC	써모피셔사이언티픽
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 μm	써모피셔사이언티픽	88553
나노ACQUITY	바다
휴먼 세럼	시그마-알드리치	H4522-20mL
CO2 인큐베이터	파나소닉
모노메틸 오리스타틴 E	케이맨 화학	16267
나노드롭 2000	써모피셔사이언티픽		미량 분광 광도계
인턴트블루	익스페디온	ISB1L	Coomassie 기반 염색
튜브 50 mL, 114x28mm, PP	사르슈테트	62.547.254	원뿔형 튜브
Amicon Ultra-15 원심 필터 장치 50,000 NMWL	머 크	UFC905024	원심 여과 농축기(단백질 A 풀다운 후)
Amicon Ultra-4 원심 필터 장치 50,000 NMWL	머 크	UFC805024	원심 여과 농축기(FPLC 또는 HPLC 정제 후)
Zeba 스핀 탈염 컬럼, 7K MWCO, 0.5mL	써모피셔사이언티픽	89882	크기 제외 스핀 열
튜브 PCR 0.2ml 플랫 캡	엉겅퀴 사이언티픽 주식회사	도끼-PCR-02-C-CS	PCR 튜브

) ) 니다 웰 년