Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

초록

출처: Bird, L. E., et al. 대장균에서 막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반 발현 스크리닝. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오에서는 세제 가용화 후 대장균에서 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 막 단백질 안정성을 스크리닝하기 위한 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 기술을 시연합니다. 유리 GFP가 거의 또는 전혀 없는 크기 배제 프로파일에서 대칭적인 피크를 나타내는 단백질은 분해 및 응집이 최소화된 정제된 단백질을 나타내며, 이는 이후에 구조 기능 분석을 위해 선택될 수 있습니다.

프로토콜

1.멤브레인 분획의 용해 및 분석

1. 멤브레인 분획(필요한 경우)을 해동하고, 가용화에 사용할 각 세제에 대해 멤브레인 현탁액 900μl를 1.5ml 폴리알로머 마이크로 원심분리 튜브로 분취합니다.
2. 갓 준비한 각 세제 100 μl(DDM, DM, Cymal-6 및 LDAO의 10% w/v 용액)를 지정된 1.5ml 튜브에 최종 농도 1%로 추가합니다. 진핵 생물 막 단백질의 가용화를 위해 콜레스테롤 헤미숙시네이트(0.2% 최종 농도)를 세제에 첨가할 수 있습니다.
3. 혼합물을 4 ° C에서 가벼운 교반으로 1 시간 동안 배양합니다.
4. 벤치탑 초원심분리기로 세제 불용성 분획물을 펠릿화하여 튜브가 4°C에서 45분 동안 150,000g으로 절반 이상 채워지고 상층액을 유지하도록 합니다.
   메모: 세제 가용화의 효과는 동일한 부피의 PBS에 재현탁된 세제 불용성 분획으로 가용화된 멤브레인의 GFP 형광을 측정하여 형광판 판독기를 사용하여 추정할 수 있습니다.
5. FSEC(Fluorescence-detected Size Exclusion Chromatography)를 사용하여 다양한 세제: 멤브레인 단백질 복합체의 단일 분산도를 분석합니다.
6. FSEC 분석의 경우, 0.3ml/min의 유속으로 러닝 버퍼(20mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.03% DDM)를 사용하여 분자량이 5,000 - 5,000,000인 넓은 분획 범위(예: 분자량)를 가진 크기 배제 컬럼을 평형화합니다. 모든 샘플에 이 버퍼를 사용합니다(즉, 테스트한 각 세제에 대해 변경되지 않음
).
7. 100μl의 가용성 멤브레인을 0.3ml/분의 유속으로 컬럼에 주입합니다. 형광 광학 장치를 사용하여 용리 프로파일을 모니터링합니다(488nm에서 여기, 512nm에서 방출). 인라인 형광 모니터를 사용할 수 없는 경우 분획을 수집하고 플레이트 리더에서 형광을 판독합니다.
8. 용리 부피 및 형광 강도 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 가져와 그래픽으로 표시할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜레스테롤 헤미숙시네이트	시그마-알드리치	C6512
CYMAL-6 (6-시클로헥실-1-헥실-βD-말토시드)	아나트레이스	C326 (영문
DDM(n-도데실 β-말토사이드)	제네론	D97002
DM (n-데실 β-말토사이드)	제네론	D99003
LDAO (N, N- 디메틸 -도 데실 아민 N- 산화물)	제네론	D71111
BenchMark 형광 단백질 표준물질	생명 기술	LC5928
Optima L-100 초원심분리기 45-Ti 로터 구동	벡크만 쿨터	393253
TLA-55 로터를 실행하는 Optima Max-XP 초원심분리기	벡크만 쿨터	393315
RF-20A 형광 검출기가 있는 Prominence UFLC	시마즈
Sepharose 6 10/300 GL 크기 배제 컬럼	GE 헬스케어	Tel.: 17-5172-01