DFE 기반 친화성 크로마토그래피: 높은 이온 강도 기반 용리 조건을 사용하여 미처리 샘플에서 2F5 단클론 항체를 정제하는 기술

Abstract

출처: Knödler, M. et al., 친화성 크로마토그래피 수지의 급속한 개발을 위한 활성 가교 결합 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 캡처. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 DsRed-2F5-Epitope 또는 DFE 리간드를 사용하여 2F5 단클론 항체를 정제하기 위한 친화성 크로마토그래피 기술에 대해 설명합니다. 정제된 2F5 단클론 항체는 면역 요법에 필수적인 약물입니다.

Protocol

1. 정제된 식물 추출물의 mAb 정제 테스트

1. 2F55를 함유하는 정제된 식물 추출물 100mL 또는 2F5를 포함하는 바람직한 세포 기반 발현 시스템의 상등액을 준비합니다.
2. 평형 완충액(20mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, pH 7.4), 저pH 용출 완충액(0.05M 구연산염, 0.05M 염화나트륨, pH 4.0–3.25) 및 높은 이온 강도의 용출 완충액(1.0–4.0M 염화마그네슘, 0.1M HEPES, pH 8.0)을 준비합니다.
3. 버퍼로 크로마토그래피 시스템을 플러시합니다. 크로마토그래피 시스템에 DFE 친화성 컬럼(주요 프로토콜 텍스트 참조)을 장착하고 1.0mL ^min-1의 유속으로 5CV의 평형 완충액으로 평형을 이룹니다. 280nm.
   에서 UV 흡광도 모니터링 메모: 식물 추출물 또는 세포 배양 상층액을 컬럼에 적재하면 배압이 증가할 수 있습니다. 크로마토그래피 시스템 또는 DFE 컬럼의 손상을 방지하기 위해 0.2MPa에서 고압 경고를 설정합니다.
4. 정제된 식물 추출물 또는 상등액 80mL를 0.5mL min-1의 유속으로 컬럼에 로드(1.1단계)하여 2분의 접촉 시간을 보장합니다. 획기적인 곡선 재구성을 위해 2mL 분획으로 관류 샘플을 수집합니다. 즉각적인 시료 분석이 불가능한 경우 관류 시료를 4°C에서 보관하십시오.
5. 6CV의 평형 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 이 단계의 시작, 중간 및 끝에서 세척 샘플을 수집합니다.
6. 5CV의 저pH 용리 완충액 또는 높은 이온 강도의 용리 완충액(0.1M HEPES, 1.25M 염화마그네슘, pH 8.0)으로 mAb 2F5를 용리합니다. UV 280nm 신호가 기준선보다 5mAU 높을 때 DFE 분율을 수집합니다.
   1. 각 epitope-antibody pair에 대한 용리 완충액을 최적화합니다. 2F5의 경우 1.25M 염화마그네슘이 제품 회수율과 리간드 안정성 사이에서 최적의 균형을 이루었습니다.
      메모: 염화 마그네슘 용액은 침전되기 쉽습니다. 따라서 염화 마그네슘을 ~ 700mL의 물에 녹입니다. HEPES를 물 100mL에 별도로 용해시키고 pH를 8.0으로 조정하십시오. 용해 된 염화 마그네슘 용액을 HEPES 용액에 첨가하고 1.0 L의 최종 부피에 물을 첨가하십시오. 염화마그네슘을 용해한 후 pH를 조정하면 침전이 발생할 수 있으므로 pH를 조정하지 마십시오.
7. Bradford 방법, 리튬 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(LDSPAGE) 및 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분광법을 사용하여 1.4–1.6단계에서 채취한 모든 샘플을 분석합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
디에스레드	프라운호프 IME	해당 없음	스탠다트
HiTrap NHS 활성화 세파로스 HP, 1 mL	GE 헬스케어	Tel.: 17-0716-01	크로마토그래피 컬럼
헤페스	칼 로스 GmbH	9105.3	버퍼 구성 요소
염화마그네슘	칼 로스 GmbH	KK36.2	버퍼 구성 요소
전화: 3110	무슨일보	2AA110	pH 측정기
Sephadex G-25 미세, 가교 덱스트란	GE 헬스케어	17003301	크로마토그래피 수지
소금	칼 로스 GmbH	P029.2	버퍼 구성 요소
구연산나트륨	칼 로스 GmbH	HN13.2	버퍼 구성 요소