박층 크로마토그래피 기반 효소 활성 분석: 박층 크로마토그래피를 사용하여 체외 피로포스포키나제 활성을 측정하는 기술

초록

출처: Pokhrel, A., et al. Clostridium difficile의 (p)ppGpp Synthetase에 대한 정제 및 체외 활성 분석. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 피로포스포키나제 활성을 결정하기 위한 박층 크로마토그래피 기반 효소 분석을 보여줍니다. 이 방법은 뉴클레오티드 합성 및 인산 전달 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

1. 박층 크로마토그래피에 의한 단백질 활성 분석

1. 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트를 준비합니다.
   1. 폴리에틸렌이민(PEI)-셀룰로오스 플레이트를 탈이온수로 세척하여 준비합니다. 이중 증류수가 담긴 유리 챔버에 플레이트를 ~0.5cm 깊이까지 놓습니다.
   2. 물이 접시 상단으로 이동하도록 합니다.
      참고: 접시 없이 접시를 사용할 수 있으므로 접시를 세척해야 하는 것은 아니지만 세척하면 결과 이미지의 선명도가 높아집니다. 플레이트를 두 개의 수직 방향으로 세척하면 수지에 존재하는 모든 오염 물질이 플레이트의 한쪽 모서리에서 격리됩니다(그림 1).
   3. 유리 챔버에서 플레이트를 꺼내 벤치탑 선반에 올려 밤새 말리십시오(12–18시간).
   4. 부드러운 연필로 한쪽 가장자리에서 2.0cm 떨어진 곳에 마른 접시를 표시하여 샘플이 TLC에 적용될 위치를 표시합니다. 2μL 샘플의 경우 1.0cm 이상 떨어진 곳에 샘플을 적용합니다(그림 1).
      참고: 이렇게 하면 인접 스폿을 명확하게 분리할 수 있으며, 이는 신호 정량화에 매우 중요합니다. 셀룰로오스 수지가 긁히지 않는 한 표면의 작은 연필 자국은 용매 이동을 방해하지 않습니다.
   5. 실험을 계획할 때 항상 각 플레이트의 한 지점을 사용하지 않은 상태로 두십시오.
      참고: 이렇게 하면 샘플 정량화를 위한 빈 레인이 제공됩니다(그림 1). 20cm TLC 플레이트에는 19개의 스팟을 위한 공간이 있습니다.
2. 효소 활성 분석
   1. 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM 암모늄 아세테이트, 10 mM KCl, 1 mM DTT 및 0.6 mM ATP (아데노신 삼인산)를 포함하는 0.6x 완충 혼합물을 준비합니다 .
      참고: 이 혼합물은 대량으로 준비되고 나중에 사용할 수 있도록 10μL 분취액으로 동결될 수 있습니다. 믹스를 여러 번의 동결-해동 주기에 적용하지 마십시오.
   2. 3 μM RSH(Rel/Spo 동족체 효소), 1x 완충액 혼합물, 0.6 mM GDP(구아노신 이인산), 1.2 mM MgCl₂를 포함하는 개별 반응을 준비합니다. 10 μL 반응당 1.0 μCi의 ^γ-32P-ATP(방사선 표지 ATP)를 추가하고 뉴클레아제 자유수를 사용하여 반응을 원하는 부피로 높입니다. 뉴클레오티드 함유 혼합물에 RSH를 추가하면 효소 활성 분석이 시작되므로 다른 성분이 혼합된 후 RSH를 추가합니다.
      참고: 최종 반응량은 샘플링된 시점의 수에 따라 달라집니다. 2 μL/시점을 샘플링하려면 각 4개의 시점에 대해 10 μL의 반응 혼합물을 조립합니다.
   3. 오염된 뉴클레아제 활성으로부터 ATP 가수분해를 제어하려면 단백질이 없는 10 μL 반응을 조립하고 병렬로 배양합니다. t = 0 및 실험 종료 시 2μL 샘플을 발견하여 단백질이 없는 상태에서 ATP가 가수분해되지 않았는지 확인합니다.
   4. RSH를 첨가하는 즉시 2 μL를 제거하고 t = 0 min 샘플로 라벨링된 PEI-셀룰로오스 플레이트에 묻습니다.
   5. 37 °C에서 반응을 배양하고 원하는 시점에서 2 μL 분취량을 제거합니다.
      참고: 샘플이 셀룰로오스 플레이트에 흡착되면 효소 활성이 중단됩니다. 현상 전에 마지막 스폿을 플레이트에 추가한 후 10-30분 정도 기다려 완전한 흡착 및 시료 건조를 보장합니다.
3. 박층 크로마토그래피
   1. 크로마토그래피 챔버를 1.5 M 1.5 M KH₂PO₄ (pH 3.64)로 0.5 cm.
      깊이까지 채웁니다. 참고: 필요한 부피는 크로마토그래피 탱크의 치수에 따라 다릅니다. 구부리지 않고 TLC 플레이트를 삽입할 수 있을 만큼 충분히 넓은 바닥이 평평한 유리 용기는 덮개를 추가하여 현상 탱크로 사용할 수 있습니다. TLC 플레이트는 플라스틱 필름으로 덮인 유리 비커에서 현상할 수 있도록 깨끗한 면도날로 더 좁은 스트립으로 절단할 수 있습니다.
   2. 플레이트의 하단 가장자리를 솔벤트에 담그십시오. 용매가 플레이트 상단으로 이동하도록 합니다(~90분).
      참고: 용매 이동은 플레이트 상단에서 중단되고 더 오래 담그는 동안 샘플이 손실되거나 함께 실행되지 않지만, 플레이트를 하룻밤 동안 용매에 두어서는 안 됩니다. 4시간 이상 담그면 수지가 플레이트 지지부에서 분리되어 신호 손실이 발생할 수 있습니다.
   3. 크로마토그래피 탱크에서 플레이트를 제거하고 탁상형 건조대에 놓습니다.
   4. 접시를 밤새 자연 건조시키십시오.
      알림: 헤어 드라이어를 사용하여 건조를 가속화할 수 있습니다. 건조도는 수지의 색상으로 평가할 수 있으며, 젖으면 어두워지고 완전히 건조되면 사용하지 않은 판의 색상으로 돌아갑니다.
   5. 플레이트가 건조된 후 방사성 물질이 이미징 카세트로 전달되지 않도록 플레이트를 플라스틱 필름으로 감싸고 자가 방사선 촬영으로 분석합니다(그림 2).
4. 데이터 분석
   1. 분리된 반응을 포함하는 PEI-셀룰로오스 플레이트를 실온에서 4시간 동안 인광계 카세트에 노출시킵니다.
      알림: 이것은 표시된 농도의 신선한 ^γ-32P-ATP를 사용하여 매우 선명한 이미지를 생성하기에 충분한 노출입니다. 더 적은 양의 방사선 표지 기판을 사용하면 노출 시간을 12-16시간으로 늘릴 수 있습니다.
   2. 형광영상기에서 카세트를 이미지화합니다.
   3. 그래픽 사용자 인터페이스가 있는 이미징 소프트웨어를 사용하여 Draw Rectangle을 선택하고 마우스를 사용하여 하나의 전체 레인과 해당 레인 내에 포함된 ATP 및 ppGpp(Guanosine tetraphosphate) 스폿 주위에 직사각형 ROI를 그려 ROI(관심 영역)를 그립니다(그림 2).
   4. 선택(Select), 복사(Copy) 및 붙여넣기(Paste) 명령(또는 사용 중인 이미징 소프트웨어에 따라 해당 명령)을 사용하여 다른 레인 내에서 동일한 ROI를 그려 ROI가 각 레인의 동일한 영역 내에서 신호를 측정하도록 합니다. 공백으로 사용할 사용되지 않는 레인의 ROI를 포함합니다.
   5. Analyze | 도구 | ROI 매니저 | 이미징 소프트웨어의 명령을 추가하고 PEI 셀룰로오스 플레이트에 그려진 모든 ROI를 선택합니다.
   6. Analyze | 측정 설정 | 명령을 측정하고, 각 ROI 내에서 신호 강도를 정량화하고, 측정값을 스프레드시트로 내보냅니다(그림 2). 실험 신호에서 빈 ROI 값을 뺍니다.
      
   7. 다음 공식을 사용하여 각 레인 내에서 블랭크된 신호 중 ATP 및 ppGpp에 기인하는 비율< 계산합니다> 참고: ROI는 인광광측정기와 호환되는 상용 소프트웨어 또는 무료로 사용할 수 있는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용하여 도출하고 정량화할 수 있습니다.

결과

그림 1: TLC 플레이트의 준비. (A) 플레이트는 바닥 가장자리를 물(파란색)에 넣어 1차원으로 세척합니다. 오염 물질(노란색)은 용매와 함께 플레이트 상단으로 이동합니다. (B) 접시가 완전히 건조된 후 첫 번째 세척에 대해 90° 회전하고 다시 물이 접시 상단으로 이동하도록 하여 2차원으로 세척합니다. (C) 세척 후 모든 오염 물질은 플레이트의 한쪽 모서리에 격리됩니다. 세척된 TLC 플레이트의 수지는 샘플이 발견되어야 하는 위치를 나타내기 위해 부드러운 연필로 부드럽게 표시할 수 있습니다. 2 μL 샘플의 경우 스폿 사이에 최소 1cm가 있으면 적절한 샘플 분리가 보장됩니다. 샘플은 플레이트의 '바닥'에서 2cm 떨어진 곳에서 발견됩니다. 샘플 도포 후 용매는 '상단'으로 흐르도록 허용되며, 여기서 모든 오염 물...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박층 크로마토그래프(TLC) 개발 탱크	일반 유리 부는 회사	80-3
폴리 에스테르 지지대가있는 폴리에틸렌 (PEI) - 셀룰로오스 플레이트 (20cm x 20cm, 100μm 두께)	시그마-알드리치	Z122882-25개
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml 리드, 100 μCi	퍼킨 엘머	NEG002A
아데노신 5'-삼인산(ATP) 100 mM	바이오 베이직 캐나다	AB0311
구아노신-5'-디포스페이트 디소듐 염(GDP)	알파 에자르	AAJ61646MC/E
스토리지 형광체 스크린	GE 헬스케어 생명과학	BAS-IP TR 2040 E 삼중수소 스크린
Storm 860 인광계	GE 헬스케어 생명과학	-

년