고성능 박막 크로마토그래피: 호중구에서 지질의 예비 분리 및 정량화를 위한 기술

초록

출처: Brogden, G., et al. 호중구의 지질 변화와 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하는 방법. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 인간 말초 혈액 유래 호중구에서 지질의 예비 분리 및 정량화 기술을 보여줍니다. 이 기법은 HPLC를 진행하기 전에 표적 분석물질의 초기 평가에 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 콜레스테롤, 인지질 및 스핑고미엘린을 포함한 여러 지질의 양을 반정량화하는 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC)

1. 다음 4가지 실행 용액과 염색 용액을 준비합니다.
   1. 용액 1: 에틸 아세테이트(26.6%), 1-프로판올(26.6%), 클로로포름(26.6%), 메탄올(26.6%) 및 염화칼륨(9.6%)을 혼합합니다. 0.25g의 KCl을 100mL의 HPLC 품질 물에 용해시켜 KCl을 준비합니다.
   2. 용액 2: n-헥산(73%), 디에틸 에테르(23%) 및 구연산(2%)을 혼합합니다.
   3. 솔루션 3: 100% n-헥산.
   4. 증류수(90mL)와 황산구리 7.5g을 혼합하여 염색액을 준비한 후 인산 10mL를 첨가합니다.
2. 별도의 유리 챔버에 각 용액을 최대 5mm까지 채웁니다. 각 챔버의 실행 속도를 높이기 위해 모든 종류의 여과지를 추가하십시오.
3. 20 x 10cm HPTLC 실리카겔 60 유리판을 첫 번째 실행 용액에서 실행 용액이 플레이트 상단에 도달할 때까지 사전 배양합니다. 그런 다음 110 °C에서 10 분 동안 건조시킵니다.
   메모: 이 플레이트는 나중에 알루미늄 호일에 사용하기 위해 보관하고 사용하기 전에 110 °C에서 10 분 동안 건조 할 수 있습니다.
4. 인간 말초 혈액 유래 호중구에서 얻은 지질 펠릿을 200 μL의 클로로포름/메탄올(1:1) 용액에 용해시키고 37 °C에서 15분 동안 배양하여 용해시킵니다.
5. 자와 부드러운 연필을 사용하여 원하는 샘플 수와 하나 이상의 표준물질에 대한 로딩 지점을 표시합니다. 첫 번째 및 두 번째 실행 솔루션에 대해 각각 약 4cm와 6cm로 실행 거리를 표시합니다.
6. 샘플을 로드하려면 새로운 샘플을 로드하기 전에 10μL 주사기를 클로로포름/메탄올(1:1)로 3회 세척합니다. 각 시료를 10μL씩 적하하여 가능한 한 작은 영역에 시료를 집중시킵니다. 샘플은 최소한 중복으로 로드해야 합니다.
7. 흐르는 용액 1을 사용하여 플레이트를 첫 번째 챔버에 수직으로 놓습니다(단계 1.1.1). 균일한 마이그레이션 속도를 달성하기 위해 플레이트가 유리 챔버의 벽과 평행한지 확인하십시오.
8. 용매 라인이 첫 번째 표시에 도달하면 플레이트를 제거하고 건조시킨 다음 두 번째 용액에 놓습니다. 두 번째 실행 솔루션과 세 번째 실행 솔루션에 대해 유사한 단계를 반복합니다. 용매 전면이 플레이트 상단에 도달할 때까지 플레이트를 용액에 그대로 둔 다음 제거하고 RT에서 1분 동안 건조합니다.
9. 플레이트를 황산구리 용액에 7초 동안 놓습니다. 플레이트를 제거하고 완전히 건조시킨 다음 170°C에서 7분 동안 오븐에서 굽습니다. 접시가 식을 때까지 기다립니다.
10. 박층 크로마토그래피 및 겔 분석 소프트웨어와 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 스캔하고 분석하여 분해된 지질 띠를 식별할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1-프로판올	시그마-알드리치	33538
10μL 주사기	해밀턴	701 NR 10 μl
디 에틸 에테르	시그마-알드리치	346136
에틸 아세테이트	칼 로스	7336.2
구리(II)황산펜타하이드레이트	머 크	1027805000
클로로포름	칼 로스	7331.1
CP ATLAS 소프트웨어	라자르소프트웨어	2
메탄올	칼 로스	7342.1
n-헥산	칼 로스	7339.1
인산	시그마-알드리치	30417
염화칼륨	머 크	4,9,361,000
HPTLC 실리카겔 60	머 크	105553

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