폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 마우스 폐 조직에서 분리된 다양한 사슬 길이의 헤파란 황산염을 검출하는 분석 기법

초록

출처: LaRiviere, W. B. et al., 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 은 염색에 의한 글리코사미노글리칸 검출. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 마우스 폐 조직에서 분리한 헤파란 황산염의 분리 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 고립 및 정제된 글리코사미노글리칸의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

1. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 필요한 용액을 미리 준비합니다(표 1).
   메모: 샘플에 있을 것으로 예상되는 글리코사미노글리칸의 크기에 따라 분해 겔 용액의 아크릴아미드 백분율을 선택합니다. 15%는 더 큰 단편(길이가 30개 이상의 이당류 소단위)을 분해하는 데 권장됩니다. 더 작은 단편(길이 <20 이당류 소단위)의 경우 22%.
2. 빈 카세트를 PAGE 탱크에 넣습니다. 15mL 튜브에 resolving gel 용액 10mL, 10% 과황산암모늄 60μL(새로 준비해야 함) 및 TEMED 10μL(TEMED를 마지막으로 추가)를 혼합합니다. 튜브를 부드럽게 2-3회 뒤집습니다. 피펫을 사용하여 위의 10mL 용액을 카세트에 빠르게 첨가합니다. 탈이온화된 여과수 2mL를 오버레이하고 분해 겔이 30분 동안 중합되도록 합니다.
   메모: 다음 PAGE 프로토콜은 13.3 x 8.7cm(너비 x 길이), 1.0mm 두께의 총 부피가 약 12mL인 주조 카세트를 사용하는 수직 PAGE 시스템에 최적화되었습니다. 다른 카세트 시스템을 사용할 수 있지만 최종 사용자의 최적화가 필요할 수 있습니다.
3. 분해 겔이 완전히 중합된 후, 오버레이된 물을 버리고 스태킹 겔을 다음과 같이 캐스팅합니다: 15mL 튜브에 스태킹 겔 용액 3mL, 10% 과황산암모늄 90μL(새로 준비해야 함), TEMED 3μL(마지막으로 TEMED 추가)를 혼합합니다.
4. 튜브를 부드럽게 2-3회 뒤집습니다. 피펫을 사용하여 응고된 분해 젤 위에 스태킹 젤 용액을 빠르게 추가합니다. 카세트를 가장자리까지 채웁니다. 세트에 포함된 빗을 완전히 삽입하십시오. 스태킹 젤이 30분 동안 중합되도록 합니다.
5. 젤이 중합되면 카세트 바닥에서 테이프 스트립이 제거되었는지 확인하고 카세트를 PAGE 탱크 어셈블리에 다시 넣습니다.
6. 상부 및 하부 챔버를 각각 상부 및 하부 챔버 버퍼로 채웁니다.
7. 1.11.4단계에서 건조된 샘플을 필요한 최소 부피의 탈이온되고 여과된 물(최대 PAGE 겔에 있는 웰 부피의 50%)에 용해시킵니다. 샘플 로딩 버퍼와 1:1로 혼합합니다. 샘플과 HS 올리고당 "ladders"(표 1 참조)를 겔에 로드합니다.
8. 100V에서 5분 동안 젤을 미리 실행합니다. 그런 다음 20-25분(15% 폴리아크릴아미드 분해 젤의 경우), 40-50분(18% 폴리아크릴아미드 분해 젤의 경우), 90-100분(22% 폴리아크릴아미드 분해 젤의 경우) .
   동안 200V에서 젤을 실행합니다. 메모: 200V 실행 시간의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다. 페놀 레드는 길이가 2 폴리머 소단위체인 헤파린 올리고당보다 먼저 이동합니다(즉, 중합도 2 또는 dp2). 브로모페놀 블루는 DP10-DP14보다 먼저 이동합니다. 최상의 결과는 페놀 레드 밴드가 거의 이동하도록 전압이 가해질 때 얻어지지만 완전히 겔의 바닥으로 이동하지는 않습니다. 그에 따라 실행 시간을 조정합니다.

결과

표 1: 정제된 글리코사미노글리칸의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 필요한 용액. 모든 용액은 사용하기 전에 여과(0.22μm)해야 합니다.

참고: 모든 용액은 사용하기 전에 여과(0.22μm)해야 합니다.
용액	처방	구성	코멘트
분해능 젤/하부 챔버 러닝 버퍼(2 L 또는 4 L)	붕산, MW 61.83	2...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
과황산암모늄(고체)	써모피셔 사이언티픽	BP179-25	전기영동 등급
Barnstead GenPure Pro 정수 시스템	써모피셔 사이언티픽	10-451-217PKG	모든 물 탈이온화/정화 시스템은 허용되는 대체품입니다
붕산(고체)	써모피셔 사이언티픽	대답73-500	분자 생물학 등급
브롬페놀 블루(고체)	써모피셔 사이언티픽	나392-5
PAGE용 Criterion 빈 카세트(두께 1.0mm, 12+2웰)	바이오 라드	3459901	1.0mm 두께의 PAGE 캐스팅 카세트 시스템으로 충분합니다
Criterion PAGE 셀 시스템(셀 및 전원 공급 장치)	바이오 라드	1656019	유사한 수직 젤 PAGE 시스템이 작동합니다)
EDTA 이나트륨 염(고체)	써모피셔 사이언티픽	전화: 02-002-786	분자 생물학 등급
글리신(고체)	써모피셔 사이언티픽	G48-500	전기영동 등급
염산(액체)	써모피셔 사이언티픽	대답466-250
N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드(고체)	써모피셔 사이언티픽	BP171-25	전기영동 등급
페놀 레드(고체)	써모피셔 사이언티픽	P74-10	유리 산
설탕 (고체)	써모피셔 사이언티픽	BP220-1	분자 생물학 등급
테메드(N,N,N',N'-테트라메틸렌디아민)	써모피셔 사이언티픽	BP150-20	전기영동 등급
트리스 베이스(솔리드)	써모피셔 사이언티픽	BP152-500	분자 생물학 등급
진공 필터 장치, 일회용, 0.22uM 기공 PES, 500mL 용량	써모피셔 사이언티픽	569-0020	대체 용량 및 필터 재료 허용
아크릴아미드(고체)	써모피셔 사이언티픽	BP170-100	전기영동 등급
헤파린 유래 데카당류(dp10)	갈렌 사이언티픽	호10
헤파린 유래 헥사당(dp6)	갈렌 사이언티픽	호06
헤파린 유래 올리고당(dp20)	갈렌 사이언티픽	호20