단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

초록

출처: Sultana, S. et al. 단백질 독성 스트레스 인자로 대장균 치료 후 단백질 응집체의 추출 및 시각화. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 단백질에 대한 변성 폴리아크릴아미드 기반 분리 기술을 보여줍니다. 이 기술은 분자량에 따라 단백질을 예비 식별하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. SDS-PAGE를 사용하여 추출된 단백질 응집체의 분리 및 시각화

1. 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 준비
   1. 두 개의 분리 겔의 경우 이중 증류수(ddH₂O) 5.1mL, Tris-HCl(pH 8.8) 3.75mL, 20%(w/v) SDS 7.5mL, 30% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1) 용액 6mL, 10% w/v 과황산암모늄 75mL, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 10mL를 15mL 원심분리기 튜브에 넣고 기포가 생기지 않도록 부드럽게 혼합합니다. 유리판 안에 1mL 피펫을 사용하여 젤을 붓고 위쪽 2cm에 혼합물을 남겨 둡니다. 분리 젤 상단에 70% 에탄올을 추가하고 두 층 사이에 균일한 계면을 허용합니다.
   2. 분리 겔의 중합 후, ddH₂O 1.535 mL, Tris-HCl 625 mL (pH 6.8), 20 % (w / v) SDS 12.5 mL, 30 % 아크릴 아미드 / 비스아크릴 아미드 (29 : 1) 용액 335 mL, 10 % w / v 과황산 암모늄 12.5 mL 및 TEMED 2.5 mL를 피펫팅하여 스태킹 겔을 준비합니다. 분리 젤에서 에탄올을 제거하고 스태킹 젤 용액을 추가합니다. 기포가 생기지 않도록 원하는 수의 포켓이 있는 빗을 삽입합니다. 20-30분 동안 중합을 기다립니다.
2. 각 샘플과 단백질 래더의 4μL를 별도의 웰에 로드하고 실온에서 45분 동안 144V에서 Tris-Glycine 러닝 버퍼(표 1)의 겔을 실행합니다.
   메모: 브로모페놀 밴드가 젤 밖으로 이동하려고 할 때 젤을 중지하십시오.
3. 예열된 Fairbanks 용액 A(표 1)에 로커에서 30분 동안 젤을 염색합니다.
4. 로커에서 원하는 배경(예: 밤새)이 될 때까지 미리 예열된 Fairbanks 용액 D(표 1)에서 젤을 탈색합니다.

결과

솔루션	조리법
버퍼 A	10mM 인산칼륨(pH 6.5), 1mM EDTA
버퍼 B	2% 노니뎃 P-40을 함유하는 버퍼 A. 나중에 사용할 수 있도록 실온에 보관할 수 있습니다.
Fairbanks A (염색 용액)	이소프로판올 25%, 빙초산 10%, 쿠마시 R-250 1.4g
Fairbanks D (염색 제거 솔루션)	10% 빙초산 용액
용해 버퍼	10...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
화학/시약
아세톤	피셔 사이언티픽	67-64-1
30% 아크릴아미드/비사아크릴아미드 용액 29:1	바이오 라드	1610156
과황산암모늄	밀리포어 시그마	A3678-100지
Bluestain 2 단백질 사다리, 5-245 kDa	골드바이오	P008-500
β-메르캅토에탄올	밀리포어 시그마	M6250-100ML
브로모페놀 블루	골드바이오	나-092-25
쿠마시 브릴리언트 블루 R-250	MP 바이오메디컬 LLC	821616
에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA)	시그마-알드리치	SLBT9686
빙하 아세트산	밀리포어 시그마	ARK2183-1L
글리세롤, 99%	시그마-알드리치	G5516-1L
글리신	골드바이오	G-630-1
이소프로판올(2-프로판올)	시그마	402893-2.5엘
10x MOPS 버퍼	테크노바	M2101
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	시그마-알드리치	L3771-500G
테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)	밀리포어 시그마	T9281-50ML
트리스 베이스	골드바이오	T-400-1
재료/장비
전원 공급 장치	써모피셔 사이언티픽	EC105 (영어
로커	알칼리 과학	RS7235
작은 유리판	바이오 라드	1653311
스페이서 플레이트(1mm)	바이오 라드	1653308
분광 광도계	열과학	3339053
15 mL 원심분리기 튜브용 테이블탑 원심분리기	벡크만-쿨터
수직 겔 전기영동 챔버	바이오 라드	1658004
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10 웰 빗	바이오 라드	1653359

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