RNA 분석을 위한 변성 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 형광 표지된 인산화 RNA 올리고뉴클레오티드를 Non-Phosphorylated Equivalents에서 분리하는 기술

초록

출처: Pillon, M. C., et al., 작은 뉴클레오티드 기질의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하기 위한 비방사성 분석법. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오에서는 인산화된 RNA 종과 인산화되지 않은 RNA 종을 분리하기 위한 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 시연합니다. RNA 종은 겔에서 레이저 검출을 위해 형광 표지됩니다.

프로토콜

1. 젤 전기 이동법

1. 15% 아크릴아미드/8M 요소 젤 솔루션을 준비합니다.
   주의: 아크릴아마이드는 신경독소이므로 주의해서 다루어야 합니다. 취급 시에는 항상 장갑, 실험복, 고글을 착용하십시오.
   1. 150mL 유리 비커에 사전 혼합된 40% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 29:1 용액 22.5mL, 10x TBE 6mL, 요소 28.8g 및 RNase-free 물을 총 부피 59mL에 결합합니다. 용액을 부드럽게 저어줍니다.
      메모: RNA 기질 길이에 따라 폴리아크릴아미드의 비율을 변경하면 인산화되지 않은 RNA와 인산화된 RNA 사이의 분리능이 향상될 수 있습니다.
   2. 요소를 녹이려면 용액을 전자레인지에서 20초 동안 가열하고 액체를 저어준 다음 즉시 용액을 전자레인지에 다시 20초 동안 더 넣습니다. 요소가 완전히 녹을 때까지 용액을 부드럽게 저어줍니다.
   3. 유리 비커를 찬물이 담긴 얕은 수조에 넣어 용액을 천천히 식힙니다. 유리 비커를 둘러싼 냉수 수위가 유리 비커 내부의 용액 수위보다 높은지 확인하십시오. 이것은 효율적인 열 전달을 촉진합니다. 5분 기다리세요.
      메모: 유리 비커가 따뜻하다고 느끼면 이 프로토콜을 계속하지 마십시오. 물은 25 °C 미만이어야 합니다. 5분 후에도 여전히 따뜻하면 수조의 물을 깨끗한 찬물로 교체하고 5분 더 기다립니다.
   4. 0.22μm 일회용 여과 장치를 사용하여 용액을 여과하고 가스를 제거하여 미립자와 미세한 기포를 제거합니다.
2. 변성 젤을 붓습니다.
   1. 비누와 따뜻한 물을 사용하여 전체 크기가 31.0cm x 38.5cm인 젤용으로 설계된 짧고 긴 유리판을 청소합니다. 각 유리판에 95% 에탄올을 뿌리고 유리를 닦아 수분을 제거합니다.
      메모: 두 플레이트 중 하나는 유리판 샌드위치를 분리할 때 젤 손상을 방지하기 위해 실리콘화될 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜은 유리판을 분리하지 않고 RNA를 시각화하도록 설계되었기 때문에 이 단계가 필요하지 않습니다.
   2. 긴 유리판을 상자 위에 수평으로 놓아 벤치탑에서 들어 올리십시오.
      주의: 아크릴아마이드는 독성이 있으므로 젤 주입 스테이션은 엎질러진 액체를 흡수할 수 있는 벤치 페이퍼로 덮어야 하며 절차가 완료된 후 즉시 폐기물 봉투에 넣어야 합니다.
   3. 긴 유리판의 긴 가장자리를 따라 깨끗한 0.4mm 스페이서를 놓습니다.
   4. 긴 판 위에 짧은 유리판을 놓고 짧은 판, 긴 판 및 스페이서의 가장자리가 정렬되었는지 확인합니다. 세 개의 균일한 간격의 금속 클램프를 사용하여 각 면을 고정합니다.
   5. 3.1단계에서 준비한 15% 아크릴아미드/8M 요소 용액에 TEMED 24μL를 첨가하고 용액을 혼합합니다.
   6. 1.2.5단계에서 용액에 600μL의 10%(w/v) APS를 추가하고 용액을 부드럽게 혼합합니다.
   7. 즉시 유리판 사이에 용액을 붓습니다.
      메모: 거품이 생기지 않도록 용액을 부을 때 유리잔을 두드리십시오.
   8. 유리판 샌드위치 상단에 깨끗한 0.4mm, 32웰 빗을 조심스럽게 추가합니다.
   9. 아크릴아마이드가 중합될 때까지 최소 30분을 허용합니다.
3. 변성 젤을 실행합니다.
   1. 가열 블록을 75°C로 설정합니다.
   2. 유리 플레이트 샌드위치를 함께 고정하는 금속 클램프를 제거하고 유리 플레이트 샌드위치를 철저히 세척하고 건조시킵니다.
   3. 유리판 샌드위치를 짧은 접시가 안쪽을 향하도록 하여 젤 장치에 넣습니다.
   4. 100mL의 10x TBE와 1.9L RNase가 없는 물을 결합하여 0.5x TBE 러닝 버퍼를 준비합니다. 러닝 버퍼(running buffer) 600mL를 겔 장치의 상부 및 하부 챔버에 추가합니다.
   5. 빗을 부드럽게 제거하고 주사기를 사용하여 우물을 철저히 헹굽니다. 참고: 이 단계는 우물에서 요소를 제거하는 데 중요합니다.
   6. 50W에서 30분 동안 젤을 미리 실행합니다.tage는 약 2,000V입니다. 주의: 이 젤 장치는 높은 와트에서 작동합니다.tage 및 사용자는 예방 조치를 취해야 합니다.
   7. 주사기를 사용하여 우물을 철저히 헹굽니다.
      메모: 이 단계는 샘플을 웰에 균일하게 적재하는 데 중요합니다.
   8. 펄스 스핀은 담금질된 반응을 돌립니다. 그런 다음 75°C에서 3분 동안 튜브를 배양합니다. 펄스 스핀을 반복합니다.
   9. 웰당 10μL의 샘플을 즉시 로드하고 50W.
      에서 3시간 동안 겔을 실행합니다. 메모: 형광 표지된 RNA는 빛에 민감합니다. 따라서 젤 장치를 호일로 덮으십시오.
4. 변성 젤을 이미지화합니다.
   1. 전원 공급 장치를 끄고 젤 장치의 상부 챔버를 배수합니다.
   2. 유리판 샌드위치의 바깥쪽을 비누와 물로 씻고 말리십시오. 젤을 운반하는 동안 유리판 샌드위치를 호일로 덮습니다.
   3. 유리판 샌드위치를 정량적이고 민감한 형광 검출이 가능한 레이저 스캐너의 스테이지에 장착합니다.
      메모: 이 젤은 최대 해상도를 위해 매우 얇습니다. 이러한 이유로 이 프로토콜은 유리판을 통해 형광 표지된 RNA를 직접 시각화하여 유리판 샌드위치에서 겔을 제거하는 어려움을 피하도록 설계되었습니다. 시중에서 판매되는 저형광 유리판을 사용하면 신호 대 잡음비를 개선하여 캡처된 신호를 증가시킬 수 있습니다.
   4. 원하는 형광단에 대한 레이저 스캐너의 여기 및 방출 파장을 설정합니다.
      메모: 최적 excitation 및 emission 파장은 특정 형광단에 따라 다를 수 있습니다. FAM 형광단의 경우 여기 파장과 방출 파장은 각각 495nm와 535nm입니다.
   5. 레이저 스캐너 스테이지에서 시각화할 영역을 정의하고 제조업체의 지침에 따라 겔을 이미지화합니다(그림 1).

결과

그림 1: 인산화된 RNA의 변성 겔 분석의 예. 500nM SC-ITS2 RNA로 배양된 Las1-Grc3(110nM)의 시험관 내 RNA 키나아제 분석. X는 Las1-Grc3가 없는 대조 반응을 표시하고 검은색 삼각형은 0-10mM에서 ATP의 적정을 나타냅니다. C2 RNA는 Las1 nuclease에 의한 SC-ITS2 RNA 절단의 결과이며 Grc3 PNK 활성을 위한 내인성 기질입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.4mm 34웰 빗	바이오라드	1653848
0.4mm 스페이서	바이오라드	1653812
0.5 M EDTA 산도 8.0	KD메디컬	RGF-3130
1M 염화마그네슘	KD메디컬	CAC-5290
1M 트리스 pH 8.0	KD메디컬	RGF-3360
40% 아크릴아미드/비스 용액 29:1	바이오라드	1610146
5M 염화나트륨	KD메디컬	RGF-3720
과황산암모늄(APS)	바이오라드	Tel.: 161-0700
ATP	시그마	A2383-1G
붕산	시그마	B0394
브로모페놀 블루 나트륨 염	시그마	B5525-5G
유리판	토마스 사이언티픽	1188K51
Hoefer SQ3 시퀀서	회퍼	해당 사항 없음
이미지 J 소프트웨어	해당 사항 없음	해당 사항 없음	https://imagej.nih.gov/ij/
표지된 RNA 올리고뉴클레오티드	증권 시세	맞춤 주문
Pharmacia EPS 3500 전원 공급 장치	파마시아	해당 사항 없음
Steriflip 0. 22 um 여과기	밀리포어	5FCP00525
테마드	바이오라드	Tel.: 161-0800
트리스 베이스	시그마	트리스로
Typhoon FLA 9500 젤 이미저	GE 헬스케어	해당 사항 없음
초순수 DEPC 물	인비트로젠	750023
울트라 퓨어 글리세롤	인비트로젠	제19E1056865
요소	피셔 케미컬	U15-500

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