2차원 반변성 아가로스 겔 전기영동: 크기 이질성에 따라 다형성 아밀로이드 섬유를 분리하는 기술

Abstract

출처: Hanna-Addams, S., et al. 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유의 크기 이질성을 확인하기 위해 2차원 반변성 세제 아가로스 젤 전기영동을 사용합니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 아밀로이드 섬유의 2차원 반변성 세제 아가로스 젤 전기영동 기반 분리를 보여줍니다. 이 기술은 이질적인 크기에 따라 다형성 아밀로이드 응집체를 분리합니다.

Protocol

1. 샘플 준비

1. 10% 소 태아 혈청과 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 10mL의 10cm 조직 배양 접시에서 HT-29 생성 HT-29 대장암 세포를 배양합니다. 37 ° C 인큐베이터에서 5 % CO₂로 밤새 세포를 배양합니다.
   1. 세포가 80% 포화도까지 성장한 후 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. 트립신 용액 3mL를 넣고 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
   2. 세포가 접시에서 완전히 해리된 후 10mL의 배양 배지를 추가하고 10mL 피펫으로 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 1,000 x g의 속도로 셀을 원심분리합니다. 배지를 흡인하고, 5mL의 배양 배지에 세포를 재현탁하고, 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 플레이트 2 x 10⁶ 셀은 각각 2 개의 10cm 접시에 있습니다.
   3. 세포가 5% CO₂가 포함된 37°C 인큐베이터에서 밤새 부착하고 회복되도록 합니다. 20ng/mL Tumor Necrosis Factor-Alpha(TNF-α), 100nM Smac-mimetic, 20μM pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK(판카스파제 억제제)로 아밀로이드 형성을 유도하기 위해 한 접시에 트리트먼트를 적용합니다. 이 조합은 TSZ로 축약됩니다. 차량이 있는 다른 접시를 대조군으로 취급하십시오.
2. 적절한 시간(보통 6시간) 후에 세포 용해물을 수확합니다.
   1. 플라스틱 스크레이퍼로 플레이트에서 세포를 긁어내고 10mL 피펫을 사용하여 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1,000 x g의 속도로 4°C에서 3분 동안 셀을 원심분리합니다.
   2. 얼음처럼 차가운 PBS 10mL에 재현탁하고 4°C에서 3분 동안 1,000 x g으로 원심분리하여 세포를 2회 세척합니다. PBS 용액을 흡인합니다.
      메모: 여기에서 세포 펠릿을 액체 질소에 동결하고 최대 80°C에서 최대 1개월 동안 보관하여 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.
   3. 세포 펠릿을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 0.3mL의 용해 완충액을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 20,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기. 상등액은 전체 세포 용해물입니다.
      메모: 여기에서 샘플을 -20°C에서 최대 몇 개월 동안 보관하여 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.
   4. Bradford 분석법으로 단백질 농도를 측정합니다. 4x SDD-AGE 로딩 버퍼를 추가하여 20μL의 3μg/μL 샘플을 준비하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

2. 젤 준비 및 실행

1. 유리 비커에 200mL의 1x Tris-acetate buffer(TAE)에 아가로스 2g을 넣고 전자레인지에서 가열하여 아가로스를 녹입니다. 0.1% SDS의 최종 농도를 위해 20% SDS 1mL를 추가합니다. 조심스럽게 소용돌이쳐 섞습니다. SDS 추가 후 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
2. 아가로스 용액을 15cm x 14cm 젤 슬래브에 붓습니다. 1mL 피펫을 사용하여 기포를 제거합니다. 상단에 20웰 빗 하나를 놓습니다.
3. 1차원: 60μg의 전체 세포 용해물을 맨 오른쪽 레인에 피펫으로 넣습니다. 0.1% SDS가 포함된 TAE를 러닝 버퍼로 사용하여 60V에서 약 4시간 동안(염료 전면이 젤을 통해 약 3/4이 될 때까지) 젤을 실행합니다.
4. 2차원: 젤을 시계 반대 방향으로 90° 조심스럽게 회전합니다(그림 1A). 60V에서 약 4시간 동안 젤을 실행합니다.
   메모: 일반적인 작동 조건은 4V/cm 젤 길이입니다. 실행 조건이 1차원과 2차원에 대해 정확히 동일해야 합니다.

Results

그림 1. 실험적 프로토콜.(A) 2차원 반변성 세제 아가로스 젤 전기영동(2D SDD-AGE)의 개략도. 빨간색으로 표시된 가장 오른쪽 레인에 샘플을 로드하는 것으로 시작합니다. 1차원 실행이 종료된 후 젤을 시계 반대 방향으로 90° 회전합니다. 2차원 전기영동을 실행합니다. 실선 화살표는 첫 번째 차원 계단진행의 방향을 나타내고, 점선 화살표는 두 번째 차원 계단진행의 방향을 나타냅니다. (B) 모세관 작용에 의한 전달의 스키마

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
겔 전기영동 장치	어부	HE99XPRO	젤 달리기를 위한 appratus.
아그로스	폭스바겐	97062-250	아가로스 젤용.
DMEM을 참조하십시오.	시그마	D6429	세포 배양용
소 태아 세럼	시그마	F4135	세포 배양용
페니실린-스트렙토마이신	시그마	P4333	세포 배양용
트립신 용액	시그마	T4049	세포 배양용
조직 배양을 위한 PBS	시그마	D8662	세포 배양용
재조합 TNF	우리 실험실에서 만들었습니다		necroptosis를 유도하기 위해. 참조 성구 11.
SMAC-모방	Xiaodong Wang 박사의 선물		necroptosis를 유도하기 위해. 참조 성구 11.
ZVAD-FMK(마이크로소프트 파이엠케이)	에이펙스바이오	A1902	necroptosis를 유도하기 위해. 참조 성구 11.
세포 계수기	바이오 라드	1450102	모델 TC20, 셀 계수용
Pierce™ BCA 단백질 분석 키트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	23225	세포 용해물의 단백질 농도 측정용
세포 리프터	어부	07-200-364	접시에서 세포를 제거하려면
용해 완충액(1L)			20 mL 1 M 트리스 pH 7.4 10mL 글리세롤 30mL 5M NaCl 840mL ddH2O 10mL 트리톤-X100 (원하는대로 프로테아제 및 인산염 억제제)
10X TAE (1 L)			48.4g 트리스 베이스 11.42mL 빙초산 20mL, 0.5M EDTA, 산도 8 ddH20 내지 1 L
4X SDD-AGE 로딩 버퍼(50mL)			5mL 10X TAE 10mL 글리세롤 4mL 20% SDS 0.5 mL 10% 브로모페놀 블루<브롬/> 31 mL ddH2영형
PBST 세척 버퍼(1L)			100mL 10xPBS 800mL ddH2O 1mL 트윈20
10X PBS(10리터)			800g NaCl 20g KCl 144g Na2HPO4·2H2O 24g KH2PO4 10L에 ddH2O 추가