네이티브 단백질 복합체 분리를 위한 Multimer-PAGE: 조직 용해물에서 원형(intact) 멀티머 단백질을 분리하기 위한 블루 네이티브-PAGE와 SDS-PAGE로 구성된 하이브리드 분리 기법

Abstract

출처: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: 생물학적 샘플에서 단백질 복합체를 포착하고 분해하는 방법. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 조직 균질체에서 천연 단백질 복합체를 분리하기 위한 multimeric PAGE에 대해 설명합니다. 이 기술은 blue native-PAGE 및 SDS-PAGE 기술의 하이브리드입니다. 분리된 복합체는 세포 기능에서의 역할을 특성화하고 연구할 수 있습니다.

Protocol

1. 조직 준비

1. 10mL의 4x BN-PAGE 샘플 버퍼(200mM Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methane(Bis-Tris), 200mM NaCl, 40% w/v glycerol, 0.004% Ponceau S, pH 7.2).
   준비 메모: 이 원액은 미리 만들어 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 1x 상업용 프로테아제 억제제 칵테일 1개를 포함하는 750μL dH₂O에 250μL의 4x 샘플 버퍼를 희석합니다. 얼음 위에서 소용돌이치고 차가워집니다.
3. 깨끗한 dounce homogenizer.
   의 30번의 스트로크로 1mL 1x 얼음처럼 차가운 BN-PAGE 샘플 버퍼에서 20mg의 표적 조직을 균질화합니다. 메모: 이 시연 실험의 대상 조직은 전체 쥐의 뇌 조직입니다. 균질화 후, 시료는 2% 디지토닌과 같은 중성 세제로 처리하여 가용화되고 막 단백질의 전기영동을 허용할 수 있습니다.
4. 균질액을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 14,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 세포 내용물을 펠릿화합니다. 원심분리 후 상층액을 얼음 위의 깨끗한 튜브에 담습니다.
5. 제조업체 지침에 따라 비신코닌산(BCA) 또는 유사한 단백질 정량 분석을 사용하여 상층액 단백질 농도를 측정하십시오.
6. 균질산염 샘플에 세제가 포함되어 있는 경우 균질화 용액이 0.25% Coomassie가 되기에 충분한 수용액에 5% Coomassie Blue G-250을 첨가합니다.

2. BN-페이지

1. 25mL 20x 블루 네이티브(BN) 전기영동 완충액 스톡(1.0M Bis-Tris, 1.0M tricine, pH 6.8)을 0.002% Coomassie Blue를 포함하는 475mL dH₂O로 희석하여 500mL의 1x 러닝 버퍼를 만듭니다.
   1. 샘플에 세제가 포함되어 있는 경우 대신 0.02% Coomassie를 포함하는 250mL의 1x 러닝 버퍼와 0.02% Coomassie를 포함하지 않는 다른 250mL를 만듭니다.
2. 냉각 버퍼를 4 °C로
냉각합니다.
3. 제조업체 지침에 따라 폴리아크릴아미드 젤 주입 카세트를 청소하고 조립합니다.
4. 표준 레시피에 따라 BN 폴리아크릴아미드 겔(3% T 적층층, 6% T 분해층)을 붓고 웰 빗을 놓습니다.
5. 겔이 중합된 후 카세트를 dH₂O로 헹구고 제조업체 지침에 따라 전기영동 장치를 조립합니다.
6. 웰 빗을 제거하고 웰에 1x BN-PAGE 러닝 버퍼를 채웁니다. 샘플이 로드될 때까지 내부 챔버 전체를 버퍼로 채우지 마십시오.
   1. 샘플에 세제가 포함되어 있으면 0.02% Coomassie Blue.
      이 포함된 버퍼로 웰을 채웁니다. 알림: 2.7°C에서 2.9-4단계를 수행합니다.
7. 겔 로딩 팁을 사용하여 20μg의 단백질을 함유한 부피의 균질액을 원하는 웰에 피펫으로 주입합니다. 1x BN-PAGE 샘플 버퍼와 동일한 부피를 사용하지 않는 웰에 피펫으로 넣습니다.
   메모: BCA 분석에서 측정된 단백질 농도를 사용하여 웰에 추가할 균질액의 적절한 부피를 계산합니다.
8. 샘플이 로드된 후 내부 챔버를 1x BN-PAGE 러닝 버퍼로 채웁니다. 젤이 완충액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 다음으로, 외부 챔버를 제조업체가 지정한 수준까지 1x 러닝 버퍼로 채웁니다.
   1. 샘플에 세제가 포함되어 있는 경우 내부 챔버를 0.02% Coomassie Blue가 함유된 1x 버퍼로 채우고 외부 챔버를 염료가 없는 1x 러닝 버퍼로 채웁니다.
9. 전극을 전원 공급 장치에 연결하고 염료 띠가 분해 층으로 ~2cm 진행될 때까지 150V에서 겔의 단백질을 전기영동합니다. 전원 공급 장치를 중지하고 분리합니다.

3. 가교

참고: 3.1°C에서 3.6-4단계를 수행합니다.

1. 전기영동 장치를 분해하고 겔 카세트의 유리판을 분리합니다. 스태킹 레이어를 제거하고 버립니다.
2. 염료 앞면의 아래쪽 가장자리 바로 아래에 있는 젤을 조심스럽게 자릅니다. 이 절단을 가능한 한 매끄럽고 직선으로 만든 다음 사용하지 않은 젤 조각을 버리십시오. 이렇게 하면 ~2cm 너비의 수평 폴리아크릴아미드 겔 스트립이 남게 되며, 이 스트립에는 균질화 샘플의 모든 단백질이 포함됩니다.
3. 젤 스트립의 가장자리를 따라 사용하지 않은 부분을 잘라냅니다.
4. 스트립을 작은 용기에 담긴 10mL 인산염 완충 식염수(PBS)에 조심스럽게 넣고 30분 동안 견과류를 주입하여 부드럽게 혼합하여 평형을 이룹니다.
5. 평형 후 PBS를 버리고 다른 10mL로 교체하십시오. 디메틸설폭사이드에 25mM DSP를 PBS에 용해시킨 500μL의 피펫을 넣고 위와 같이 30분 동안 계속 혼합합니다(단계 3.4).
6. DSP 솔루션을 따르십시오. 2% 도데실황산나트륨(SDS)을 함유한 0.375M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염(Tris-HCl) 10mL, pH 8.8을 첨가하여 미반응 DSP를 담금질합니다. 15분 동안 너트를 계속합니다.

4. SDS 페이지

1. 젤 스트립이 담금질되는 동안 표준 방법에 따라 SDS-PAGE 젤 용액을 준비합니다. 중합 시약을 첨가하지 마십시오.
2. 담금질 후 ΒΝ 젤 스트립을 실온으로 되돌리고 스트립을 새 젤 카세트에 캐스팅합니다.
   1. 이렇게하려면 젤을 조심스럽게 집어 깨끗한 젤 카세트 스페이서 플레이트에 놓습니다.
   2. 염료 전면의 하단이 새 카세트의 상단에 가장 가깝도록 스트립의 방향을 지정합니다(즉, BN-PAGE 동안 가장 멀리 이동한 면이 새 카세트의 상단에 가장 가까워야 합니다. 젤 스트립은 이전 방향에서 뒤집어야 함). 그림 1을 참조하십시오.
   3. 상단 가장자리가 커버 플레이트의 상단 가장자리가 있을 위치와 균일하게 놓이도록 스트립을 놓습니다(즉, 새 젤의 상단에 있음). 염료 앞면이 유리판의 수평 가장자리와 평행한지 확인하십시오.
   4. 절제된 스트립의 한쪽 면을 스페이서 벽 중 하나에 대고 다른 쪽에 젤을 붓고 단백질 표준물질 또는 사다리를 로드할 수 있는 공간을 남겨둡니다.
   5. 젤 스트립의 아래쪽 가장자리에 들쭉날쭉하거나 고르지 않은 부분이 있으면 조심스럽게 잘라냅니다. 존재하는 경우 젤을 붓는 동안 거품을 가둡니다.
   6. 젤 스트립이 올바르게 배치되면 스페이서 플레이트 위에 커버 플레이트를 놓습니다. 갇힌 기포를 밀어내기 위해 부드러운 압력을 가합니다.
   7. 제조업체 지침에 따라 젤 주입 장치를 계속 조립하십시오.
3. resolving gel buffer에 중합 시약을 추가하고 혈청학 피펫을 사용하여 준비된 gel cassette에 붓습니다. 절제된 BN-PAGE 젤 스트립 아래 ~2cm까지 젤 카세트를 채워 스태킹 층을 위한 공간을 남겨둡니다.
4. 부은 젤 위에 100μL 부탄올을 추가하고 분해층의 중합을 위해 30분 동안 기다립니다. 부탄올을 붓습니다.
5. 스태킹 겔 용액에 중합 시약을 추가합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 스태킹 층을 부어 젤 카세트에 남아 있는 모든 빈 공간을 채웁니다.
   1. 스태킹 층이 부어질 때 젤 카세트를 기울여 젤 스트립 아래 공간을 채우고 기포가 갇히지 않도록 합니다.
   2. 스태킹 젤 버퍼가 젤 스트립 아래의 빈 공간을 채우면 점차적으로 젤 카세트를 평평한 발판으로 되돌립니다.
   3. 절제된 젤 스트립 옆의 빈 공간을 거의 넘칠 때까지 스태킹 젤 버퍼로 계속 채웁니다.
6. 스태킹 레이어가 30분 동안 중합되도록 합니다.
   메모: 겔이 중합되는 동안 10x SDS-PAGE 러닝 버퍼(250mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 1.9M 글리신, 1% SDS)을 만듭니다. 이것은 또한 미리 만들어 실온에서 보관할 수 있습니다.
7. 50mL 10x SDS-PAGE 러닝 버퍼 스톡을 450mL dH₂O에 희석하여 1x 작동 버퍼를 만듭니다.
8. 스태킹 층이 중합된 후 주입 장치에서 겔 카세트를 제거하고 dH_2O로 헹구고 제조업체 지침에 따라 전기영동 장치를 조립합니다.
9. 내부 챔버를 1x SDS-PAGE 러닝 버퍼로 완전히 채운 다음 외부 챔버를 제조업체가 지정한 수준까지 채웁니다.
10. 절제된 젤 스트립 옆의 공간을 분자량 래더 또는 적절한 단백질 표준물질로 채웁니다.
11. 전극을 전원 공급 장치에 부착하고 120V에서 샘플을 전기 영동합니다. Coomassie 염료가 젤에서 흘러내리면 전원 공급 장치를 중지하고 분리하십시오.
12. 항체 결합에 의한 전기 블로팅 및 단백질 검출의 표준 방법을 사용하여 겔을 분석합니다.

Results

그림 1: 일반 멀티머 PAGE 순서도.
(A) BN-PAGE 샘플 버퍼에서 균질화와 같은 비변성 방법을 사용하여 조직 용해물을 준비합니다. (B) 피펫을 BN-PAGE 젤에 용해시킨 다음 BN-PAGE 러닝 버퍼에서 전기영동(150볼트)을 수행합니다. 염료 전면이 분해 겔 안으로 ~2cm 이동할 때까지 샘플이 이동하도록 합니다. (C) 적층층과 분해층의 사용하지 않는 부분을 제거합니다. (D) 젤 스트립을 PBS에 담그고 30분 동안 흔들면서 평형을 이룹니다.(E) PBS를 제거하고 2.5mM DSP가 포함된 PBS에 젤 스트립을 다시 담그십시오. 30분 동안 흔듭니다. (F

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
화학 물질
ε-아미노카프로산(Aminocaproic acid)	시그마	A2504 (영어
아크릴아마이드	아크로스 오가닉스	164855000	유독.
아크릴아미드/비사크릴아미드 37.5:1 (40%T 원액)	바이오라드	Tel.: 161-0148	유독.
과황산암모늄	시그마	A3678
염소에서 토끼 IgG-HRP 방지	산타 크루즈 생명 공학	사우스캐롤라이나-2004
Bicinchoninic acid assay kit (비신초닌산) 분석 키트	써모피셔	23225
비스트리스	시그마	B9754
소 혈청 알부민	시그마	A9647
부탄올	피셔 사이언티픽	A399-1
화학발광 기판 키트	써모피셔	24078
쿠마시 블루 G-250	시그마-알드리치	B0770
디지토닌	시그마	D141	유독.
디메틸 설폭사이드	피셔 사이언티픽	D128-1 (영어
디티오비스(숙시니미딜프로피오네이트)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	22585
건조 무지방 우유	랩사이언티픽	M0841
글리세롤	시그마	G9012
글리신	피셔 사이언티픽	BP381-5
Halt Protease 억제제 칵테일	써모피셔	78430
염산	피셔 사이언티픽	A144SI-212	적정용. 신랄한.
메탄올	피셔 사이언티픽	대답412-4	PVDF 멤브레인 활성화용. 유독.
토끼의 단클론 항 α-synuclein IgG	산타 크루즈 생명 공학	사우스캐롤라이나-7011-R
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민	시그마	T9281
N,N'-메틸렌비스아크릴아미드	아크로스 오가닉스	16479	유독.
NP40	보스턴 바이오 제품	P-872
폴리소르베이트 20 (트윈-20)	피셔 사이언티픽	BP337-500
폴리비닐리덴 플루오라이드 전달 멤브레인	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	88518
폰소 S	시그마	P3504
염화칼륨	피셔 사이언티픽	P217-3
인산칼륨 일염기성	시그마	P9791
프로테아제 억제제 칵테일	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	88265
SDS 솔루션(10% w/v)	바이오라드	Tel.: 161-0416
소금	피셔 사이언티픽	BP358-212
나트륨 도데 실 설페이트	시그마	L37771
인산나트륨 일염기성	피셔 사이언티픽	BP329-1
트리신	시그마	T0377
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-500
트리스-HCl(0.5M 버퍼, pH 6.8)	바이오라드	Tel.: 161-0799
트리스-HCl(1.5M 완충액, pH 8.8)	바이오라드	Tel.: 161-0798
악기
GE 이미지퀀트 LAS 4000	GE 헬스케어	제28-9558-10
ImageJ 소프트웨어 NIH
Synergy H1 마이크로플레이트 리더	(주)바이오텍
젤 포머 + 스탠드	비오라드
마이크로퓨지 22R 원심분리기	벡크만 쿨터
2 mL dounce 균질화기
와류 믹서	피셔 사이언티픽
초음파 조직 균질화기	피셔 사이언티픽	FB120220