모세관 전기영동: 형광 표지된 중합효소 연쇄 반응 앰플리콘을 분석하는 기법

초록

출처: Gulla, S. et al., 다중 PCR 및 모세관 전기영동에 의한 어류 병원성 박테리아 Yersinia ruckeri의 다중 궤적 가변 번호 탠덤 반복 분석. J. Vis. 특급 (2019년)

이 동영상은 다양한 샘플에서 얻은 형광 표지된 PCR 앰플리콘을 크기에 따라 분석하는 모세관 전기영동 기법을 설명합니다. 그것은 각 단편에 있는 표지된 형광 염료의 도움으로 단편의 염기쌍 길이를 결정하는 이동 패턴을 생성합니다.

프로토콜

1. 모세관 전기영동 설정 및 실행 조건

1. PCR 앰플리콘을 확인한 후 PCR 산물을 정제수에 1:10(v/v)으로 희석합니다. 간단히 밀봉하고 혼합하고 원심 분리하십시오.
2. 흄 찬장에서 작업하여 PCR 산물당 9μL의 포름아미드와 0.5μL의 크기 표준으로 구성된 마스터 믹스 부피를 준비합니다(10% 잉여 부피 허용). 0.5μL의 희석된 PCR 산물을 첨가하기 전에 사용 가능한 CE 시스템에 적합한 플레이트의 웰에 9.5μL를 간단히 와류로 분배합니다. 간단히 밀봉, 혼합 및 원심 분리.
   주의: 조심히 다루십시오. 포름아미드를 물과 혼합하면 독성이 있는 포름산이 생성됩니다.
3. PCR 열 순환기를 사용하여 95°C에서 3분 동안 샘플을 변성시킨 후 4°C로 무기한 냉각합니다. 원심분리기를 잠시 하고 제조업체의 지침에 따라 보정된 CE 시스템에 플레이트를 로드합니다.
4. 선택한 장치에 적합한 시약을 사용하여 단편 분석 CE를 실행하고 다음 설정을 수행합니다: 60 °C; 1.6 kV에서 5초 주입(cm당 32 V); 15 kV에서 32분 실행 시간(cm당 300 V). 24개의 모세관(50cm)에서 24개의 웰에 대한 CE 절편 분석은 일반적으로 약 50분이 소요됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Avant 3500xL 유전자 분석기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A30469	모세관 전기영동 단편 분석에 사용됩니다.
GelRed 핵산 염색제, 10,000X 수중	비오티움	41003	겔 전기영동 중에 사용되는 형광 핵산 염료.
GeneMapper 소프트웨어 5	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	4475073	모세관 전기영동에서 전기영동을 판독하는 데 사용됩니다.
GeneScan 600 LIZ 염료 크기 표준 v2.0	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	4408399	모세관 전기영동 중에 사용되는 크기 표준.
Hi-Di 포름아미드	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	모세관 전기영동 중에 사용되는 탈이온화된 포름아미드. 작동하는 aliquouts를 준비합니다.
Milli-Q 워터	해당 없음	해당 없음	PCR 및 모세관 전기영동 중에 사용되는 정제수. 표준 레시피; 사내에서 생산됩니다.
3500 Dx/3500xL Dx 유전자 분석기용 POP-7 폴리머	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	모세관 전기영동 중에 사용되는 분리 매트릭스.
UV 기반 겔 이미징/시각화 시스템	선호되는 대로.	해당 없음
소용돌이	선호되는 대로.	해당 없음

) ) ) ) )