알칼리성 단세포 겔 전기영동: 화학요법 후 개별 암세포의 DNA 손상을 정량적으로 추정하기 위한 민감한 기술

초록

출처: Lu, Y., et al. 혜성 분석을 사용하여 체외 DNA 손상 평가 J. Vis. Exp. (2017년)

이 비디오에서는 독소루비신 처리된 세포에서 단일 및 이중 가닥 DNA 절단을 모두 정량화하는 알칼리 단일 세포 전기영동 분석을 시연합니다. 알칼리성 조건은 DNA 염기쌍 사이의 수소 결합을 방해하여 DNA 가닥의 완전한 풀림 및 분리를 초래합니다. 이를 통해 전기영동 시 아가로스 겔에서 손상되지 않은 DNA 단편과 손상된 DNA 단편의 차등 이동을 가능하게 하여 손상되지 않은 DNA가 원형 혜성 머리를 형성하고 손상된 DNA 단편이 빠르게 이동하는 혜성 모양의 구조를 드러낼

수 있습니다.

프로토콜

1. 시약 준비

1. PBS 1개
   1. 100mL 10x PBS를 900mL dH_2O로 희석하고 pH 측정기를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.
2. 용해 용액 (LS)
   1. 900 mL dH₂O에서 2.5 M NaCl, 100 mM Disodium EDTA, 10 mM Tris 염기 및 200 mM NaOH를 준비합니다. 혼합물이 완전히 용해되는 데 일반적으로 약 20 분이 걸립니다. pH 측정기를 사용하여 pH를 10으로 조정합니다. 1% 소듐 라우릴 사르코시네이트와 1% 트리톤 X-100을 넣고 최종 부피를 1,000mL로 조정합니다. 사용하기 전에 최소 30분 동안 4°C로 식히십시오.
3. 알칼리 전기영동 용액(AES), pH >13
   1. 800mL dH₂O에 200mM NaOH 및 1mM 디소듐 EDTA를 준비합니다.pH를 조정하고 pH >13인지 확인합니다. 최종 부피를 1,000mL로 조정합니다. 사용하기 전에 신선하게 만들고 사용하기 전에 최소 30분 동안 4°C로 식히십시오
   .
4. 염색 용액
   1. 1. 30 mL Tris-EDTA 완충액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM Disodium EDTA, pH 7.4)에 1 μL 10,000x 녹색 형광 핵산 염색 (예 : SYBR Green)을 첨가하고 4 °C에서 보관하십시오.빛으로부터 보호하십시오.
5. 1% 저융점 아가로스
   1. 1% 저융점 아가로스(100mL dH_2O에 1g)를 전자레인지에 녹입니다. 15-20초마다 아가로스를 소용돌이쳐 아가로스가 완전히 녹았는지 확인합니다. 사용하기 전에 아가로스를 37°C 수조에 최소 20분 동안 두십시오.
6. 예열 피펫 팁
   1. P200 피펫 팁의 좁은 끝을 3mm 자르고 아가로스를 피펫팅하기 전에 37°C에서 예열합니다.

2. 혜성 슬라이드 준비

1. 슬라이드 코팅
   1. 1% 아가로스(100mL dH_2O에 1g)를 전자레인지에 2-3분 동안 또는 아가로스가 완전히 녹을 때까지 녹입니다. 유리 현미경 슬라이드를 아가로스에 담그고 보푸라기가 없는 천으로 슬라이드의 한쪽 면을 닦습니다.
   2. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 자연 건조하거나 더 빠른 건조를 위해 50°C에서 가열합니다. 건조 후 투명한 아가로스 필름을 형성해야 합니다. 코팅된 슬라이드를 사용하기 전에 37°C에 놓습니다.
2. 단일 세포 현탁액의 준비
   1. 신경교종 세포를 배양하고 치료합니다.
      1. 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 10 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM-Ham F-12 배지에서 U251 MG 세포를 5%_CO2로 37°C에서 배양합니다.
      2. 1mL 트립신을 사용하여 3분 동안 세포를 분해하고 FBS와 함께 DMEM-Ham F-12 배지를 사용하여 트립신을 중화합니다. 15mL 튜브에 모으고, 300 x g에서 4분 동안 회전하고, 배지를 흡인하고, 1x PBS에서 2 x 10⁵ cell/mL로 세포를 현탁합니다.
         메모: 세포 샘플은 분석을 시작하기 직전에 준비해야 하며 모든 샘플은 빛으로 인한 DNA 손상을 방지하기 위해 어둡거나 어두운 환경에서 처리해야 합니다.
      3. 세포 현탁액을 1% 용융된 저융점 아가로스(37°C에서)를 1:10(v/v)의 비율로 결합하고, 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합한 다음 즉시 30μL를 아가로스로 코팅된 슬라이드에 피펫팅합니다. 피펫 팁의 측면을 사용하여 아가로스/세포 혼합물을 펴서 얇은 층을 형성합니다.
      4. 슬라이드를 4°C의 어두운 곳에서 10분 동안 평평하게 놓고 겔화 시간을 30분으로 늘리면 습도가 높은 환경에서 샘플의 순응도를 높일 수 있습니다.
      5. 슬라이드를 4°C LS에 1시간에서 하룻밤 동안 어둠 속에서 담그십시오.
3. 단일 세포 전기영동
   1. 알칼리성 혜성 분석용
      1. LS에서 슬라이드를 부드럽게 제거하고 여분의 버퍼를 배출한 다음 DNA가 풀릴 수 있도록 4°C에서 1시간 동안 AES에 부드럽게 담그십시오. 슬라이드를 어두운 곳에 보관하십시오.
      2. 전기영동 슬라이드 트레이에 미리 냉각된 AES를 추가하고, 슬라이드에서 0.5cm를 초과하지 않고(전기영동 장치의 크기에 따라 다름) 슬라이드를 내부에 놓고 캡으로 덮습니다. 전원 공급 장치 볼륨을 설정하십시오.tage를 1V/cm(전극 사이의 길이)로 설정하고 30°C에서 4분 동안 실행합니다.
      3. 슬라이드에서 과도한 전기영동 용액을 배출합니다. 실온에서 각각 5분 동안 dH_2O에 슬라이드를 두 번 부드럽게 담그십시오.
      4. 실온에서 70% 에탄올에 슬라이드를 5분 동안 부드럽게 담그십시오. 염색을 진행합니다.
4. 스테인 코멧 슬라이드
   1. 어둠 속에서 10-15분 동안 37°C에서 드라이 슬라이드합니다.
   2. 건조된 각 아가로스에 50 - 100 μL 녹색 형광 핵산 염색 용액을 놓고 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 염색합니다.
   3. 슬라이드를 dH₂O로 짧게 헹구고 어둠 속에서 37°C에서 완전히 건조시킵니다. 이미지 획득 및 분석을 진행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x PBS(Ca++, Mg++ 무료)	테크노바	P0196
염화나트륨	시그마	S5886
에디타	테크노바	0308
트리즈마 베이스	시그마	T1503
나오	시그마	72068
나트륨 라 우릴 사르코시 네이트	시그마	엘7414
트리톤 X-100	시그마	93443
SYBR 그린	인비트로젠	S33102 (영어
낮은 융점 아가로스	인비트로젠	16520
아가로스	인비트로젠	16500
95% 에탄올	워너-그레이엄	#64-17-5
트립신	지브코	제25300-054
유리 티슈 슬라이드	전자 현미경 과학	63422-11
킴와이프	킴벌리-클라크
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	덴빌
피펫 팁	날카로운
마이크로파	아반티
물목욕	정밀
수평 전기영동 챔버	트레비겐	코메타세이 ES II
전원 공급 장치	바이오 라드
부 화기	퀸시 랩	모델 12-140E
형광 현미경	자이스	LSM700
마이크로피펫터	에펜도르프

회 ) 년 년 호 년 시리즈