PCR 산물의 단편 크기 조정을 위한 미세유체 모세관 전기영동: 크기에 따라 DNA 단편을 분리하는 마이크로칩 기반 전기영동 분리 기술

초록

출처: Wang, H., Zhu et al. 취약한 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신-구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 강력한 중합효소 연쇄 반응 기반 분석법. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 PCR 앰플리콘의 크기에 따라 분리하는 미세유체 모세관 전기영동 기법을 설명합니다. 이 기술은 형광 염료와 표준 분자 크기 마커를 사용하여 단편 크기를 조정하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. PCR 산물의 단편 크기 조정

1. 시작하기 전에 DNA 염료 농축액, DNA 겔 매트릭스, DNA 마커, DNA 래더 및 정제된 DNA 샘플을 30분 동안 실온에서 평형을 이룰 수 있습니다.
2. 프라이밍 스테이션 설정
   1. 새 시약 배치를 사용할 때 주사기(재료 표 참조)를 교체하십시오.
   2. 베이스 플레이트를 조정하고 주사기 클립의 레버를 풀고 상단 위치까지 밀어 올립니다.
3. 사이징 소프트웨어(재료 표 참조)를 시작하고 젤-염료 혼합물을 준비합니다.
4. Vortex 염료 농축액을 10초 동안 유지하고 스핀다운합니다. 염료 25μL를 겔 매트릭스 바이알에 추가합니다. 혼합 용액을 잘 소용돌이치고 스핀 다운합니다.
   1. 젤-염료 혼합물을 스핀 필터로 옮깁니다. 스핀 필터를 마이크로 원심분리기에 넣고 실온에서 1,500 x g ± 20%로 10분 동안 회전합니다.
      참고: 염료로 용액을 빛으로부터 보호하고 사용 후에는 4°C에서 보관하십시오. 젤 염료 혼합물은 한 번 준비되면 약 15 개의 칩에 사용할 수 있습니다. 젤 염료 혼합물을 사용하기 전에 매번 30분 동안 실온과 평형을 이루도록 하십시오.
5. 젤-염료 혼합물을 로드합니다.
   1. 프라이밍 스테이션에 새 DNA 칩을 삽입합니다. 9μL의 겔-염료 혼합물을 "G"로 표시된 웰에 추가합니다. 플런저가 1mL 표시에 위치했는지 확인한 다음 프라이밍 스테이션을 닫으십시오.
   2. 클립이 잡힐 때까지 주사기 플런저를 아래로 누릅니다. 정확히 30초 동안 기다린 다음 클립을 놓습니다. 5초 동안 기다린 다음 플런저를 1mL 위치로 천천히 다시 당깁니다.
   3. 프라이밍 스테이션을 열고 9μL의 겔-염료 혼합물을 "G"로 표시된 웰에 추가합니다.
6. 래더 기호가 표시된 웰에 5μL의 마커를 추가하고 12개의 샘플 웰 각각에 5μL의 마커를 추가합니다. 우물을 비워 두지 마십시오.
7. 1 μL의 DNA ladder를 ladder symbol이 표시된 well에 추가합니다. 12개의 샘플 웰 각각에 PCR 산물(사용된 웰) 1μL 또는 초순수 1μL(사용하지 않은 웰)를 추가합니다. 와류 믹서와 와류의 어댑터에 칩을 수평으로 놓고 표시된 설정(1rpm)에서 2,400분 동안 와류
를 넣습니다.
8. 바이오분석기 기기에 칩을 삽입하고 5분 이내에 기기에서 칩을 실행합니다.
9. 분석이 완료되면 사용한 칩을 기기에서 즉시 제거하십시오.
10. 350μL의 탈이온수를 전극 세척기의 웰 중 하나에 천천히 추가합니다. 바이오분석기의 뚜껑을 열고 전극 클리너를 그 안에 넣습니다. 뚜껑을 닫고 약 10초 동안 배양합니다. 뚜껑을 열고 전극 클리너를 제거합니다. 전극의 물이 증발할 때까지 10초 더 기다렸다가 뚜껑을 닫습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 0.2 mL PCR 튜브	액시겐	PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: TE 버퍼 1개, pH 8.0, Rnase-free	앰비언	AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 2100 Bioanalyzer 기기	애질런트	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 96웰 PCR 플레이트	써모 피셔	AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 전극 카트리지	애질런트		2100 Bioanalyzer 장비 공급
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: IKA 와류 믹서	애질런트		2100 Bioanalyzer 장비 공급
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 사이징 소프트웨어 2100 Expert 소프트웨어	애질런트		2100 Bioanalyzer 장비 공급
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 테스트 칩	애질런트		2100 Bioanalyzer 장비 공급
Agilent DNA 7500 키트	애질런트	5067-1506	Fragment 크기 조정의 경우
Agilent DNA 7500 키트: DNA 7500 Ladder(노란색 캡)	애질런트		키트: Agilent DNA 7500 kit(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: DNA 7500 마커(녹색 캡)	애질런트		키트: Agilent DNA 7500 kit(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: DNA 칩	애질런트		키트: Agilent DNA 7500 kit(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: DNA 염료 농축액(파란색 캡)	애질런트		키트: Agilent DNA 7500 kit(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: DNA 겔 매트릭스 바이알(빨간색 캡)	애질런트		키트: Agilent DNA 7500 kit(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: 전극 세정제	애질런트		키트: Agilent DNA 7500 kit(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: 스핀 필터	애질런트		Agilent DNA 7500 kit 공급(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: 주사기	애질런트		Agilent DNA 7500 kit 공급(카탈로그 번호: 5067-1506)
칩 프라이밍 스테이션	애질런트	5065-4401	2100 Bioanalyzer 장비 공급
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