비환원 SDS 페이지: 이황화물 결합 다량체 단백질 복합체를 분석하는 방법

초록

출처: Rotoli, S. M. et al., 배양 중인 포유류 세포에서 이황화 결합에 의해 안정화된 다량체 복합체를 검출하기 위해 비환원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교를 결합합니다. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 다량체 단백질 복합체를 분석하기 위해 비환원 SDS-PAGE로 단백질 샘플을 분리하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 나중에 웨스턴 블로팅으로 분석할 수 있는 이황화 결합에 의해 유지되는 단백질의 멀티타이머 소단위를 유지합니다.

프로토콜

1. 요오도아세트아미드를 사용하여 유리 시스테인 잔류 물질 차단

1. 6cm² 접시에서 U-2 OS 세포를 50%-60% 포화도로 성장시키며, 10%의 소 태아 혈청과 1%의 피루브산 나트륨을 함유하는 고포도당을 57°C에서 5% CO₂로 성장시킵니다.
2. 사용 직전에 10mM 요오드아세트아미드를 새로 비축한 다음 사용하지 않은 시약은 모두 버리십시오.
3. 0.1mM 최종 농도의 요오드아세트아미드를 세포 배양 배지에 직접 첨가합니다. 접시를 실온에서 2분 동안 부드럽게 흔듭니다.

2. 세포 채취

1. 세포에서 배지를 흡인합니다.
2. 5mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세 번 세척합니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡입한 다음 차가운 PBS 1mL를 추가합니다.
3. 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 1mL 피펫을 사용하여 PBS와 세포 현탁액을 추출하고 모든 액체를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다.
4. 7,500 x g에서 4°C에서 3분 동안 세포를 회전시킵....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 프리캐스트 TGX 겔	써모피셔	XP00160
브로모페놀 블루
증권 시세	세포 신호 전달	99985
세포 용해 완충액	세포 신호 전달	9803
원심 분리기	에펜도르프	5415디
DMEM을 참조하십시오.	지브코	제11330-032
에디타	시그마 알드리치	엠101
전기영동 장치	인비트로젠	A25977
소 태아 세럼	지브코	1932693
포름알데히드	써모피셔	28908
유리-테프론 균질화기
글리세롤	시그마 알드리치	65516
글리신	증권 시세	636050
헤페스	시그마 알드리치	H0527
요오도아세트아미드	써모피셔	90034
PBS (PBS)	시그마 알드리치	P3813
전원 공급 장치	비오라드	200120
미리 염색된 마커	써모피셔	26619
증권 시세	비오라드	Tel.: 161-0302
초음파 처리기	브 랜 슨	450
트리스 베이스	증권 시세	T60040
트리스 완충 식염수	시그마 알드리치	SRE0031	트윈 20, pH 7.5
트리스-글리신 러닝 버퍼	폭스바겐	제61006
트리톤 X-100	시그마 알드리치	T8787
U-2 OS	증권 시세	HTB-96

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