$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 요오도아세트아미드를 사용하여 유리 시스테인 잔류 물질 차단
- 6cm2 접시에서 U-2 OS 세포를 50%-60% 포화도로 성장시키며, 10%의 소 태아 혈청과 1%의 피루브산 나트륨을 함유하는 고포도당을 57°C에서 5% CO2로 성장시킵니다.
- 사용 직전에 10mM 요오드아세트아미드를 새로 비축한 다음 사용하지 않은 시약은 모두 버리십시오.
- 0.1mM 최종 농도의 요오드아세트아미드를 세포 배양 배지에 직접 첨가합니다. 접시를 실온에서 2분 동안 부드럽게 흔듭니다.
2. 세포 채취
- 세포에서 배지를 흡인합니다.
- 5mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세 번 세척합니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡입한 다음 차가운 PBS 1mL를 추가합니다.
- 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 1mL 피펫을 사용하여 PBS와 세포 현탁액을 추출하고 모든 액체를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다.
- 7,500 x g에서 4°C에서 3분 동안 세포를 회전시킵니다.세포 펠릿을 남겨두고 PBS를 흡인합니다. 셀 펠릿은 가공할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다
.
3. 단백질 추출
- ddH2O에 희석된 1x 용해 완충액 100μL를 준비합니다(재료 표 참조). 사용 직전에 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 1mM 최종 농도에 첨가합니다.
- 50 μL의 1x 용해 완충액을 세포 펠릿에 직접 추가하고 현탁합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
- 40%에서 일정한 펄스 모드를 사용하여 8초 동안 초음파 처리하고(초음파 처리기에 대한 재료 표 참조, 다른 초음파 처리기에 따라 필요에 따라 조정) 추출물을 얼음 위에 유지합니다.
- 추출물을 4°C에서 16,000 x g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상등액은 용해성 단백질 분획입니다. 원하는 경우 단백질 농도를 측정하기 위해 Bradford 분석을 수행할 수 있습니다.
4. 시료 전처리
- 용해성 단백질 추출물 10 μL를 취하고 1x Laemmli SDS 샘플 버퍼 (4 % SDS, 20 % 글리세롤, 0.004 % 브로 모페놀 블루 및 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8)의 10 μL를 추가합니다. 환원 시약을 첨가하지 마십시오.
- SDS PAGE 분석이 그날 수행되는 경우 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 장기 보관의 경우 -20 °C가 적절합니다. 겔을 실행하기 직전에 샘플을 85°C에서 5분 동안 가열합니다.
5. U-2 OS 세포에서 내인성 단백질의 생체 내 포름알데히드 가교
- 175cm2 플라스크에서 U-2 OS 세포를 70%–80% 포화도로 성장시킵니다.
- 포름알데히드 가교 반응을 수행합니다.
- 흄 후드에서 상업용 공급원에서 구입한 37% 포름알데히드 용액을 분취합니다. 포름알데히드 고정제를 배지에 직접 첨가하여 최종 농도 1%로 낮추고 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
- 반응을 소멸시키려면 1.25M 글리신을 최종 농도 0.125M에 첨가하고 실온에서 로커에서 5분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
- 5mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡입하고 PBS 10mL를 추가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 긁어냅니다.
- 10mL 피펫을 사용하여 PBS와 세포 현탁액을 추출하고 전체 액체를 15mL 코니컬 원심분리 튜브에 분주합니다. 500 x g에서 4°C에서 2분 동안 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 남겨두고 PBS를 흡인합니다.
6. 핵의 분획
- pH 7.4에서 0.25M 자당, 1mM EDTA, 10mM HEPES 및 0.5% BSA의 균질화 완충액 10mL를 준비합니다. 사용 직전 PMSF를 1mM 최종 농도와 3mL의 핵 현탁액(PBS의 0.1% Triton X-100)에 첨가합니다.
- 5mL 균질화 완충액을 세포 펠렛에 직접 추가하고 완전히 현탁합니다. 현탁액을 500 x g에서 4°C에서 2분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.
- 펠릿을 5mL의 균질화 완충액에 현탁시킵니다. 꼭 맞는 유리 테프론 균질화기를 사용하여 10 스트로크 / 500 rpm으로 세포를 균질화합니다.
- 현탁액을 1,500 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
참고: 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 미토콘드리아를 분리하기 위해 상등액을 사용합니다.
- 펠릿을 1mL 핵 현탁액에 현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
- 600 x g에서 10분 동안 원심분리기 상층액을 버립니다.
- 펠릿을 1mL 핵 현탁액에 현탁시키고 다시 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 최종 펠릿은 분리된 핵이 됩니다.
7. 단백질 추출
- 1x 용해 완충액 25μL를 세포 펠릿에 직접 첨가한 후 현탁하는 것을 제외하고 섹션 4를 반복합니다.
8. 시료 준비
- 용해성 단백질 추출물 각각을 10μL씩 취하여 SDS-PAGE용 샘플 2개를 준비하고 2x Laemmli SDS-샘플 버퍼 10μL와 2-메르캅토에탄올(BME) 1μL를 추가합니다.
- 한 샘플을 37°C에서 5분 동안 가열하고 두 번째 샘플을 98°C에서 15분 동안 가열하여 포름알데히드 교차 결합을 역전시킵니다.
9. SDS-PAGE 분석
- 1x Tris-glycine 러닝 버퍼(25mM Tris, 192mM Glycine, 0.1%(w/v) SDS) 1L)를 준비합니다.
- apparatus.
를 실행하는 SDS-PAGE를 설정합니다.
참고: 이 프로토콜은 16% 프리캐스트 TGX SDS 페이지를 사용합니다. 참고로, 모든 백분율 젤을 사용할 수 있습니다.
- 제조업체 프로토콜에 따라 젤이 보관된 패키지를 열고 카세트를 제거합니다.
- 카세트 바닥에서 웰과 테이프를 감싸고 있는 빗을 제거합니다.
- 젤을 작동 장치에 넣습니다.
- 웰이 액체에 잠길 때까지 챔버를 1x 러닝 버퍼로 채웁니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 흐르는 버퍼로 우물을 헹굽니다.
- 10 μL의 사전 염색된 표준 마커와 함께 겔에 샘플을 로드합니다.
- 염료 전면이 젤 바닥에서 약 1cm 떨어질 때까지 200V에서 젤을 실행합니다.