Liquid Phase Isoelectric Focusing: Crude Gymnema sylvestre 추출물에서 생체 활성 분자를 분리하는 전기영동 기술

초록

출처: Veerapandian, R., et al. IEF(Preparative Isoelectric Focusing) 방법에 의한 생체 활성 소분자, 천연 공급원의 펩타이드 및 미생물의 단백질을 분리합니다. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 액상 등전 초점을 사용하여 식물 추출물에서 복잡한 분자를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 기본 상태의 복잡한 생체 분자를 정제하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. Gymnema sylvestre 추출물에서 소분자 및 펩타이드의 분리 및 정제

1. 식물 추출물 0.6g을 측정하고 롤러 튜브에서 5분 동안 혼합하여 증류수(60mL)에 녹입니다.
   참고: 용해되고 염이 없는 모든 생물학적 샘플은 액상 등전 초점(IEF) 기기를 사용하여 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있습니다. 최대 10mM의 완충 염 농도를 가진 시료는 약간 감소된 분해능으로 사용할 수 있습니다.
2. 가용화된 식물 추출물을 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 불용성 입자를 제거합니다.
3. 상등액(~60mL)을 80mL 원심분리 튜브에 옮기고 0.6mL의 양쪽 파일(pH 3-10)과 1%(v/v)로 혼합합니다.
4. 액상 IEF 장치를 준비합니다.
   1. 액체상 IEF 전극(양극-빨간색 버튼 및 음극-검은색 버튼)을 사용 설명서(Table of Materials)에 따라 각각의 교환막과 함께 조립합니다. 새로운 멤브레인을 사용할 때 최소 16시간 동안 음이온 교환막을 0.1M NaOH로 평형화하고 양이온 교환막을 0.1M H_3PO4로 평형화합니다.
   2. 실행 사이에 멤브레인을 전해질(0.1M NaOH 또는 0.1M H_3PO4)에 보관하고 건조되지 않도록 합니다.
   3. 이온 교환 개스킷에 있는 세 개의 직사각형 구멍을 정렬하여 전극의 내부 및 외부 부분을 조립합니다. 전극에 각각의 전해질(~25-30 mL)을 채워 멤브레인이 건조되는 것을 방지합니다.
   4. 전극 내부에 압력을 형성하여 누출을 유발할 수 있는 과도한(전극 챔버 부피의 1/3 이상) 전해질을 추가하지 마십시오.
   5. 시료 채취 포트를 기기 조립 부품과 함께 제공되는 밀봉 테이프로 덮습니다(재료 표). 샘플 수집 포트 측면은 두 개의 수직 금속 정렬 핀으로 식별할 수 있습니다. 또는 표준 밀봉 테이프를 사용하여 포트를 밀봉합니다.
   6. 포커싱 챔버 어셈블리의 모든 부분(양극 전극, 나일론 멤브레인 코어, 포커싱 챔버 및 음극 전극)을 세라믹 냉각 핑거 위에 순서대로 조립합니다.
   7. 50mL 주사기를 사용하여 사전 냉각된 증류수(표준 IEF 셀의 경우 총 부피 60mL)로 포커싱 챔버를 채웁니다.
   8. 액상 IEF 기기를 4ºC의 순환 냉각수에 연결하고 15-3,000분 동안 또는 전압이 안정화될 때까지 3W 및 3V에서 장치를 사전 실행합니다.
      알림: 일반적으로 1분 이내에 voltage는 최대 설정 값에 도달합니다. 증류수로 사전 실행하면 포커싱 챔버와 나일론 멤브레인 코어에서 잔류 이온을 제거하는 데 도움이 됩니다.
   9. 전원을 끄고 분획 분취기(fraction collector)를 사용하여 셀에서 물을 제거합니다. 밀봉 테이프로 수집 포트를 다시 밀봉합니다. 이제 챔버에서 샘플을 로드할 준비가 되었습니다.
5. 1-1/2인치 19G 뭉툭한 끝 바늘(기기와 함께 제공)이 있는 50mL 주사기를 사용하고 시료 채취 포트를 통해 준비된 시료에 양쪽 lyte(총 60mL)를 로드합니다.
6. 스탠드에서 포커싱 셀을 제거하고 전극 챔버를 두드려 기포를 제거하여 샘플 셀에서 기포를 제거합니다. 기포가 있으면 전압 및 전류 변동이 발생하고 실행에 영향을 미칩니다.
7. 장치를 수냉식수(4°C)에 연결하고 일정한 15W에서 전원 공급 장치로 분류를 시작합니다.
8. 3시간 동안 또는 볼륨이 떨어질 때까지 장치를 실행하십시오.tage는 일정한 값에 도달합니다.
   알림: 샘플이 초점을 맞추기 시작하면 전압이 일정한 값에 도달할 때까지 점차적으로 상승하기 시작합니다.
9. 실행 후 IEF 장치의 수확 버튼을 ON으로 눌러 진공 펌프에 연결된 수확 상자(20개의 플라스틱 튜브, 12mm x 75mm, 5-6mL 용량 포함)에서 분획을 수집할 준비를 합니다.
10. 20개의 수집 핀을 테이프로 밀봉된 포커싱 셀의 20개 수집 포트에 맞춥니다.
11. 밀봉 테이프를 통해 수집 핀을 밀어 넣고 진공 펌프를 동시에 켭니다(그림 1B, 1C 및 1D).
    참고: 각 챔버에서 약 3mL 분획이 매번 튜브에 수집됩니다. 분획은 후속 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다(펩타이드 정량화를 위한 SDS-PAGE, 저분자를 위한 TLC 및 생물학적 분석).

결과

그림 1: G. sylvestre 식물 추출물의 액상 IEF 장치 설정 및 분별. (A) 실행 중, (B) 분획 분취 중, (C) 분획 분취 후, (D) 액상 IEF 장치 부품, 1) 이온 교환막, 2) 집속 챔버 및 멤브레인 코어, 3) 전극 어셈블리(음극), 4) 전극 어셈블리(양극).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.45μm 실린지 필터	피셔 scientfic	TEL.09-720-004
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	바이오 라드	163-1113
Bio-Lyte 5/8 앰포라이트	바이오 라드	163-1192
소형 저온 온도 조절기	라우다 -브링크만	RM 6톤	수냉식을 4°C로 설정하면 Rotofor 냉각 코어를 통과할 때 전압에 따라 순환 수온이 약 5도 이상이 되기 때문에 0°C에서도 작동할 수 있습니다.
Gymnema 식물 잎 추출물 분말 (>25 % Gymnemic acids)	Suan Farma, 미국 뉴저지
미니 프로티안 전기영동	바이오 라드
pH 측정기	메틀러 톨레도	시즌 20	Rotofor(액상 IEF) 분획의 pH를 측정하는 데 유용합니다.
로토포	바이오 라드	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (장치 조립을 위한 Rotofor 사용 설명서)
RPMI-1640 미디엄	하이클론	DH30255.01
밀봉 테이프	바이오 라드	170-2960	스카치 테이프도 사용할 수 있습니다
Sorvall legend micro 17 원심분리기	써모 사이언티픽	75002432

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