방법 논문

Mobility Shift Affinity Capillary 전기영동: 단백질-리간드 복합체의 차등 이동에 따른 샘플-리간드 상호 작용을 분석하는 방법

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Nachbar M. et al., Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis에 의한 AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Toward Metal Ions. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 이동성-이동 친화성 모세관 전기영동을 통해 단백질-리간드 상호 작용을 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 하전 리간드를 가진 단백질의 결합 거동을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ACE 분석을 위한 솔루션 준비

  1. 1M NaOH 용액을 준비합니다.
    1. 100mL 부피 플라스크에 4.0g의 NaOH를 계량합니다.
    2. 탈이온수로 표시까지 채워 1M 스톡을 만듭니다.
  2. 0.1M NaOH 용액에 0.1M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 준비합니다.
    1. 10mL 벌브 파이펫을 사용하여 100mL 용량 플라스크에 0.1M NaOH 10mL를 옮깁니다. 탈이온수로 표시까지 채우십시오.
    2. 계량 보트에서 2.42g의 EDTA를 계량하고 0.1M NaOH 100mL에 고체 화합물을 용해시킵니다.
  3. 트리스 완충액(30mM) 용액을 준비합니다.
    1. 500mL 비이커에 트리스 3.63g, 탈이온수 200mL, 교반봉을 넣습니다. 비커를 교반 접시에 놓고 전원을 켭니다.
    2. 비커에 pH 측정기 전극을 넣고 0.1M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
    3. 1L 부피 플라스크에 용액을 채우고 탈이온수로 표시까지 채웁니다.
      참고: 이 절차를 반복해야 하며, 그렇지 않으면 전체 분석에 1L 이상이 필요하므로 더 큰 부피 플라스크가 필요합니다.
  4. 아세트아닐라이드 전기삼투압 흐름(EOF)-마커(60μM) 용액을 준비합니다.
    1. 100mL 용량 플라스크에 6mg의 아세트아닐리드와 100mL의 트리스 완충액을 추가합니다.
    2. 부피 측정 플라스크를 초음파 수조에 넣고 30분 동안 켭니다.
  5. 샘플(1mg/mL) 용액을 준비합니다.
    1. 0.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 정밀 저울에 놓고 동결 건조된 AtHIRD11 분말 0.3mg을 튜브에 추가합니다.
    2. 마이크로피펫을 사용하여 튜브에 0.3mL의 30mM Tris 완충액(pH 7.4)을 추가합니다. 단백질을 녹이기 위해 튜브를 조심스럽게 흔듭니다.
  6. 리간드 용액을 준비합니다.
    1. CaCl2 (5 mM) 원액을 준비합니다.
      1. 계량 보트를 가져 와서 분석 저울에 올려 놓고 36.76mg의 CaCl2*H2O의 무게를 잰다.
      2. 마이크로피펫을 사용하여 계량 보트의 CaCl2*H2O를 미리 준비된 Tris 버퍼와 함께 50mL 부피 플라스크로 세척합니다.
      3. 부피 플라스크에 Tris 버퍼를 표시까지 채웁니다.
    2. 나머지 원액(5mM)을 준비합니다.
      1. CaCl2*H2O 대신 다른 금속염을 사용하여 1.6.1 단계를 반복한다[MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr(NO3)2: 52.91 mg, MnCl2: 31.46 mg, SeCl4: 52.91 mg, CoCl2*2H2O: 41.47 mg, CuCl2*2H2O: 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg, 및 NiCl2*6H2O: 59.43 mg].
        메모: ZnCl2 용액의 농도는 0.5mM입니다. 이온과 내부 모세관 벽 사이의 강한 상호 작용이 관찰되었기 때문에 농도가 104 배 감소했습니다.
    3. 500μM CaCl2 용액을 준비합니다.
      1. CaCl2 원액 10mL를 채우고 100mL 부피 플라스크에 넣습니다.
      2. 부피 측정 플라스크에 Tris 버퍼를 표시선까지 채우고 플라스크를 흔듭니다.
    4. 250μM CaCl2 용액을 준비합니다.
      1. CaCl2 원액 5mL를 채우고 100mL 부피 플라스크에 넣습니다.
      2. 부피 측정 플라스크에 Tris 버퍼를 표시선까지 채우고 플라스크를 흔듭니다.
    5. 다른 스톡 솔루션에 대해 이전 단계를 반복합니다.
  7. 바이알에 용액을 채웁니다.
    메모: 반복되는 모든 실행에는 주입구 및 배출구 바이알 세트가 필요합니다. 입구와 출구에서 새로운 리간드 용액을 사용하면 각 실행 후 마이그레이션 시간의 변화를 줄일 수 있습니다.
    1. 10mL 주사기에 250μM CaCl2 용액을 채웁니다.
    2. 주사기에 0.22μm PVDF 필터를 놓고 주사기를 사용하여 용액 2mL를 필터를 통해 밀어 넣어 이 여과된 용액을 버립니다.
    3. 주사기의 나머지 250μM CaCl2 용액으로 최대 허용 부피까지 10개의 바이알을 채웁니다. 각각을 250μM CaCl2 용액 주입구 바이알로 표시합니다.
    4. 250μM CaCl2 용액으로 반쯤 채워질 때까지 10개의 바이알을 채웁니다. 각각을 250μM CaCl2 용액 배출구 바이알로 표시합니다.
    5. 다른 금속염 함유 용액에 대해 1.7.1 - 1.7.4 단계를 반복합니다.
    6. 대신 30mM Tris 버퍼(pH 7.4) 용액을 사용하여 모든 입구 및 출구 바이알 쌍에 대해 단계를 반복합니다.
      메모: 30mmol/L Tris 버퍼 pH 7.4는 금속 이온이 없는 상태에서 단백질의 이동 시간 데이터를 얻기 위해 실행 사이에 사용됩니다. EOF의 변경 사항을 무시할 필요가 있습니다.
    7. 대신 아세트아닐라이드 EOF 마커(60μM) 용액을 사용하여 하나의 바이알에 대해 위의 단계를 반복합니다. 또한 샘플(1mg/mL) 용액을 대신 사용하여 이 단계를 반복합니다.

2. 친화도 모세관 전기 영동 분석

  1. 모세관 컨디셔닝
    1. 온도 조절기를 23°C로 설정합니다.
      메모: 온도는 발표된 프로토콜에 따라 사용되며 다른 온도로 변경할 수 있습니다. 그러나 상호 작용은 온도에 따라 달라지며 그에 따라 변경됩니다.
    2. 2.5bar에서 40분 동안 모세관을 0.1M NaOH로 세척합니다.
    3. 탈이온수로 1.0bar에서 10분 동안 모세관을 세척합니다.
    4. 30mM Tris 완충액(pH 30)을 사용하여 1.0bar에서 7.4분 동안 모세관을 세척합니다.
  2. ACE 방법 준비
    1. 리간드 없이 측정하기 위한 Method를 준비합니다.
      메모: 아세트아닐라이드(Acetanilide)는 2개의 단백질 피크를 위장하기 때문에 샘플 용액에 첨가되지 않았습니다.
      1. 0.1 M EDTA 용액으로 2.5 bar에서 1분 동안 모세관을 헹굽니다.
      2. 탈이온수로 2.5bar에서 1분 동안 모세관을 헹굽니다.
      3. 평형을 위해 Tris 버퍼로 2.5bar에서 1.5분 동안 모세관을 헹굽니다.
      4. 아세트아닐라이드 용액을 0.05bar에서 6초 동안 주입하고 주입구 및 배출구 바이알을 Tris 버퍼 바이알로 변경합니다.
      5. 0.05bar를 2.4초 동안 적용하여 모세관 끝에서 아세트아닐라이드 용액을 더 안쪽으로 밀어 넣습니다.
      6. 6분 동안 10.0kV를 적용하고 200nm 파장에서 아세트아닐라이드 피크를 검출합니다.
      7. 2.2.1.1. - 2.2.1.6. 단계를 반복하여 아세트아닐라이드 용액 대신 단백질 샘플을 사용하여 모든 단백질 피크를 검출합니다.
    2. 리간드를 사용한 측정 방법을 준비합니다.
      1. 0.1 M EDTA 용액으로 2.5 bar에서 1분 동안 모세관을 헹굽니다.
      2. 탈이온수로 2.5bar에서 1분 동안 모세관을 헹굽니다.
      3. 평형을 위해 리간드 용액으로 2.5bar에서 1.5분 동안 모세혈관을 헹굽니다.
      4. 아세트아닐라이드 용액을 0.05bar에서 6초 동안 주입하고 주입구 및 배출구 바이알을 리간드가 함유된 완충액 바이알로 변경합니다.
      5. 0.05bar를 2.4초 동안 적용하여 모세관 끝에서 아세트아닐라이드 용액을 더 안쪽으로 밀어 넣습니다.
      6. 6분 동안 10.0kV를 적용하고 200nm 파장에서 아세트아닐라이드 피크를 검출합니다.
      7. 아세트아닐라이드 용액 대신 단백질 샘플을 사용하여 2.2.2.1 - 2.2.2.6 단계를 반복하고 모든 단백질 피크를 검출합니다.
    3. 2.2.1단계와 2.2.2단계를 번갈아 반복하여 다양한 단백질-금속 이온 상호 작용에 대한 전하 크기 비율의 변화를 계산합니다.
      1. 60시간마다 단백질 용액을 새 용액으로 교체하십시오.
        메모: 이 시점에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 이 절차는 피크 패턴이 실행마다 약간 다르기 때문에 리간드의 각 농도에 대해 최소 10회 반복됩니다. 용액을 60시간 이상 사용하면 변동이 너무 커집니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AtHIRD11 샘플 시즈오카 대학(그룹 하라 M. 교수) 대장균(Escherichia coli)에서 발현되는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 데하이드린 단백질(Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana)
Barefused 실리카 모세관, Polymicro Technologies (미국 피닉스) 제106815-0017 TSP050375 50 μm 내경, 363 μm 외경, 폴리이미드 코팅
애질런트 1600A Agilent Technologies(독일 발트브론)모세관 전기 영동 기기; Agilent 7100 CE를 대신 사용할 수 있습니다.
벌브 피펫 25 mL Duran Group GmbH(독일 마인츠)재질 보기 24 338 14리간드 용액 준비
Duran 유리 용량 플라스크 25 mL Duran Group GmbH(독일 마인츠) 24호 671 1457리간드 스톡 용액 준비
Duran glas 용량 플라스크 10 mL Duran Group GmbH(독일 마인츠) 전화: 24호 671 1054리간드 스톡 용액 준비
아세트아닐라이드 Sigma-Aldrich (독일 스타인하임) 397229-5지Electroosmotic flow marker (전기삼투압 유동 마커
염화망간(II) Sigma-Aldrich (독일 스타인하임) 13217리간드
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) Sigma-Aldrich (독일 스타인하임)431788-100지헹굼 성분
염화바륨 Sigma-Aldrich (독일 스타인하임)202738-5G리간드
니켈 (II) 염화물 육수화물 Sigma-Aldrich (독일 스타인하임) 654507-5지리간드
셀레늄(IV) 클로라이드 Sigma-Aldrich (독일 스타인하임)323527-10지리간드
2-아미노-2-하이드록시메틸프로판-1.3-디올(트리스) Sigma-Aldrich (독일 스타인하임)252859-100지완충 성분
염화아연(II) Merck Millipore ( 다름슈타트, 독일)1088160250리간드
스트론튬 질산염 Merck Millipore ( 다름슈타트, 독일)1078720250리간드
염화칼슘 이수화물 Merck Millipore ( 다름슈타트, 독일) 1371015000리간드
구리(II) 염화물 이수화물 Riedel-de Haën (독일, 젤체)31286리간드
Agilent ChemStation 개정판 8.04.03- SP1 Agilent Technologies(독일 발트브론)G2070-91126CE 기기를 작동하고 데이터를 수집 및 평가하기 위한 소프트웨어 패키지
호 년 년 ) 년 년 (영문)

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