2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

초록

출처: Zhan, X., et al. 인간 뇌하수체 선종 조직 단백질체 분석을 위한 질량 분석 방법과 결합된 2차원 겔 전기영동, J. Vis. Exp. (2018년)

이 비디오에서는 인간 비기능성 뇌하수체 선종(NFPA)의 종양 조직에서 얻은 복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 2차원 겔 전기영동 방법을 보여줍니다. 단백질은 1차원에서 전하를 기준으로 분리되고 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 신경외과에서 뇌하수체 선종 조직(0.2 - 0.5 mg)을 채취합니다. 즉시 액체 질소에서 동결, 그리고 나서 저장을 위해 -80 C로 옮깁니다.
2. 탈이온수 (ddH₂O)에 0.9 % NaCl 2mL를 첨가합니다. 이 용액을 사용하여 조직 표면(3x)에서 혈액을 가볍게 씻습니다.
   NOTE: 전도성이 18.2MΩ/cm인 ddH₂O가 프로토콜 전체에 사용됩니다. 조직 표면에서 혈액을 씻어낼 때 일부 조직이 손실될 수 있습니다.
3. 조직 0.5 - 0.6g당 2M 아세트산과 0.1%(v/v) β-메르캅토에탄올을 함유한 용액의 부피(10mL, 4°C)를 추가하고, 조직 균질화기로 균질화(1분, 13,000rpm, 4°C, 10x)하고, 균질화를 20초 동안 초음파 처리하고, 동결건조하고, -80°C에서 보관합니다.
4. 비신코닌산(BCA) 분석 키트를 사용하여 동결건조되고 균질화된 샘플의 단백질 함량을 측정합니다.
   메모: BCA 정량화는 절대 정량화가 아니며 측정 결과는 다른 기술자와 실험 대리인에 의해 변경됩니다. 다양한 실험에는 고정 농도 샘플 표준물질을 사용해야 합니다. 그러므로, 각 2D 젤을 위한 단백질의 최종 로딩 양은 사전 설계된 실험에서 silver-stained 또는 Coomassie-stained good-resolution 이미지로 결정될 것입니다.
   1. 약 300 μg의 동결건조된 균질화된 샘플을 단백질 추출 완충액(8 M 요소 및 4% CHAPS)의 1 부피(282 μL)에 첨가한 후, 2 시간 동안 방치하고, 수조에서 5분 동안 초음파 처리하고, 1시간 동안 회전하고, 수조에서 5분 동안 다시 초음파 처리하고, 1시간 동안 다시 회전하고, 15,000 x g에서 20분 동안 원심분리.
   2. 상용 BSA 표준(2 mg/mL)을 사용하여 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1,500, 2,000 μg/mL 농도의 BSA 표준 용액을 준비합니다.
   3. 사용하기 전에 BCA 시약 A와 B(A:B = 50:1)를 BCA 작업 용액으로 혼합하십시오.
   4. 마이크로분리 튜브에 0.1mL의 샘플 또는 표준 용액을 2mL의 BCA 작업 용액에 첨가한 다음 혼합한 다음 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로 실온에서 10분 동안 냉각하고 A_562nm OD 값을 측정합니다.
   5. 표준 선형선(A_562nm 대 BSA 농도)을 계산하여 A_562nm 값으로 샘플 단백질 함량을 계산하기 위한 회귀 방정식을 얻습니다.
5. 은 염색을 위해 150μg의 단백질 등가 동결건조 샘플을 사용하고, 18cm 고정 pH 구배(IPG) 스트립 pH 3-10 비선형(NL)의 경우 500μg의 단백질을 쿠마시 염색에 사용합니다.
   메모: IPG 드라이 스트립은 두께 0.5mm, 너비 3mm이며 7, 11, 13, 18 및 24cm를 포함한 다양한 길이와 선형 또는 비선형 pH 구배에서 pH 4-5, 4-7, 6-9 및 3-10을 포함한 다양한 pH 범위를 제공합니다. 사용되는 IPG 버퍼는 스트립에 맞아야 합니다.
6. 추출 완충액 250μL(7M 요소, 2M 티오우레아, 4%(w/v) CHAPS, 100mM DTT(사용 전 추가), 0.5% v/v 파마라이트(사용 전 추가) 및 미량의 브로모페놀 블루)를 추가합니다.
7. 용액을 30 ° C 이하로 유지 한 다음 5 분 동안 와류, 5 분 동안 초음파 처리, 50 분 동안 회전합니다.
8. 110μL의 재수화 완충액(7M 요소, 2M 티오우레아, 4%(w/v) CHAPS, 60mM DTT(사용 전 추가), 0.5% v/v IPG 완충액(사용 전 추가) 및 미량의 브로모페놀 블루)를 추가합니다. 5분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 50분 동안 회전시키고 5분 동안 와류를 회전시킨 다음 15,000 x g에서 20분 동안 원심분리합니다.
9. 상층액(350μL)을 단백질 시료 용액으로 수집합니다.

2. 2차원 젤 전기 이동법

1. IEF(1차원): 아래 설명된 대로 등전 초점 시스템에서 IEF를 수행합니다.
   1. 단백질 샘플 용액 350μL를 18cm IPG 스트립 홀더의 슬롯에 추가합니다.
   2. 18cm IPG 스트립을 단백질 샘플 용액에 젤 면이 아래로 향하게 하게 하여 놓습니다(기포 방지).
   3. IPG 스트립을 덮기 위해 3-4mL의 미네랄 오일을 추가합니다.
   4. IPG 스트립 홀더를 뾰족한 끝이 후면(+) 플레이트에 있고 사각형 끝이 전면(-) 플레이트에 오도록 등전체 초점 시스템에 조립합니다.
   5. 밤새 수분을 보충하십시오(실온에서 ~18시간).
   6. IEF 매개변수 설정: 최대 전류 스트립당 30μA, 20°C, 250V, 1h, 125Vh, 스텝 앤 홀드, 1,000V, 1h, 500Vh, 그라데이션, 8,000V, 1h, 4,000Vh, 그라데이션, 8,000V, 4h, 32,000Vh, 스텝 앤 홀드, 500V, 0.5h, 250Vh, 스텝 앤 홀드. 총 7.5시간 및 36,875Vh의 시간까지 실행하십시오.
   7. IEF 후 각 IPG 스트립을 꺼내고 불용성 종이 타월로 여분의 미네랄 오일을 제거합니다. 이제 스트립을 플라스틱 랩으로 싸서 -80 °C에서 보관하십시오.
      메모: IPG 스트립 홀더는 IPG 스트립 홀더 세척액과 증류수로 세척해야 합니다.
2. SDS-PAGE(2차원): 수직 셀 전기영동 시스템에서 SDS-PAGE 수행
   메모: 각 SDS-PAGE 젤 크기는 255 x 190 x 1mm여야 합니다.
   1. 멀티 젤 캐스터를 사용하여 12% PAGE 리졸빙 젤을 캐스팅합니다. 12% PAGE 젤을 캐스팅하려면 다음 단계를 수행하십시오.
      1. ddH₂O 270mL, 1.5M Tris-HCl (pH 8.8) 150mL, 40 % (w / v) 아크릴 아미드 / 비스아크릴 아미드 원액 180mL (29 : 1, 40 % w / v 아크릴 아미드 및 1.38 % w / v N, N'- 메틸렌 비스아크릴 아미드), 10 % 과황산 암모늄 3mL 및 TEMED 150 μL를 추가하여 비커에 겔 용액을 만듭니다. 부드럽게 섞고 거품을 피하십시오.
      2. 겔 용액을 예상 겔 높이(19cm)까지 멀티캐스팅 챔버에 부드럽게 붓습니다.
      3. 즉시 각 분해 겔에 약 3mL ddH₂O를 첨가하여 겔을 덮습니다. 젤을 약 1시간 동안 중합시킵니다.
   2. 20L의 전기영동 완충액(25mM Tris, 192mM 글리세린 및 0.1% SDS)을 준비합니다. 전기영동 분리 장치 버퍼 탱크를 이 버퍼로 채웁니다.
   3. 냉동실에서 집중된 IPG 스트립을 꺼내고 10mL의 환원 평형 완충액(375mM Tris-HCl(pH 8.8), 6M 요소, 2%(w/v) SDS, 20%(v/v) 글리세롤, 2% w/v DTT(사용 전 추가) 및 미량의 브로모페놀 블루).
   4. 10mL 알킬화 평형 완충액(375mM Tris-HCl(pH 8.8), 6M 요소, 2%(w/v) SDS, 20%(v/v) 글리세롤, 2.5% w/v 요오드아세트아미드(사용 전 추가) 및 미량의 브로모페놀 블루).
   5. 겔 평형 상태에서 멀티캐스팅 챔버를 분해하고 준비된 분해 겔 카세트를 꺼냅니다. ddH₂O로 3 번 헹굽니다. 불용성 종이 타월로 여분의 ddH₂O를 제거하고 젤 스탠드에 넣습니다.
   6. 평형을 이룬 IPG 스트립을 전기영동 버퍼로 헹구고 불용성 종이 타월로 IPG 스트립 표면의 과도한 액체를 제거합니다.
   7. IPG 스트립을 resolving SDS-PAGE 젤에 놓고 IPG 스트립의 플라스틱 면이 더 긴 유리판과 왼쪽의 뾰족한 끝부분에 닿도록 합니다.
   8. SDS 전기 이동법 완충액 (~80 °C)에 있는 뜨거운 1% 아가로스의 3-4 mL를 각 SDS-PAGE 젤의 정상에 IPG 지구를 밀봉하기 위하여 빨리 따르고, 거품 없이 더 짧은 유리판의 정상에 IPG 지구의 윗면을 아래로 두고, 그 후에 10 분 동안 중합하십시오.
   9. 조립된 겔 카세트를 수직 전기영동 시스템의 플라스틱 개스킷 사이에 수직으로 삽입합니다. IPG 스트립이 있는 겔 상단을 음극(-) 옆에 놓습니다.
   10. 겔 카세트를 담그기 위해 전기영동 버퍼의 수준을 조정합니다.
   11. 전원 공급 장치/제어 장치를 일정한 볼륨으로 연결 및 설정합니다.tage 모드를 선택하고 염료를 모니터링하면서 약 370분 동안 200V에서 실행합니다.
   12. 달리기 후에, 전기 이동법 체계에서 젤 카세트를 꺼내고, 젤 카세트에서 젤을 온화하게 제거하고, 젤이 찢어지는 것을 피하고, 2DE 분리된 단백질의 염색을 피하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ettan IPGphor 3	GE 헬스케어		등전체 초점 시스템.
Ettan DALT II 시스템	Amersham Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피스카타웨이		수직 전기영동 시스템
Ettan IPGphor 스트립 홀더	Amersham Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피스카타웨이
에탄 DALTsix 멀티겔 캐스터	Amersham Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피스카타웨이		멀티겔 캐스터
킴와이프	킴바이프		불용성 종이 타월
물	PURELAB 플렉스 기기로 제작
Polytron 모델 P710/35 균질화기	Brinkmann Instruments, 웨스트버리, 뉴욕
Pierce BCA 단백질 분석 키트	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	23227
2-D Quant 키트	GE 헬스케어	80-6483-56
BIS-아크릴아미드	암레스코	0172
아크릴아미드	암레스코	0341
디티(DTT)	시그마-알드리치	D0632
티오우레아	시그마-알드리치	T8656
요소	베텍	V900119
증권 시세	암레스코	0227
챕 스	암레스코	0465
테마드	암레스코	M146
과황산 암모늄	암레스코	M133
IPG 완충액 pH 3-10, NL	GE 헬스케어	Tel.: 17-6000-87
이모빌 드라이 스트립 pH 3-10NL, 18cm	GE 헬스케어	17-1235-01