Zymography Gel Electrophoresis: 효소 활성을 평가하여 기질 금속단백분해효소를 검출하는 전기영동 기법

초록

출처: Hu, X. et al., 자이모그래피에 의한 기능적 매트릭스 금속단백분해효소 검출. J. Vis. 특급 (2010년)

이 동영상은 세포 배양 상등액에 존재하는 기질 금속단백분해효소(MMP)의 활성을 평가하기 위한 자이모그래피 겔 전기영동 기술을 보여줍니다. 활성 MMP는 폴리아크릴아미드 겔에 내장된 MMP 특이적 기질을 분해하며, 이는 염색 후 어두운 염색된 배경에 대해 투명한 띠로 나타납니다.

프로토콜

1. 젤 로딩 및 실행

1. 모든 샘플은 효소의 기능을 유지하기 위해 적절하게 준비되어야 하며 채취 직후 사용하거나 -80°C에서 냉동 보관해야 합니다. 샘플에는 환원제(예: β-메르캅토에탄올)가 포함되어서는 안 되며 겔 로딩 전에 끓여서는 안 됩니다.
2. 카세트 내부의 젤이 들어있는 파우치를 열고 카세트를 탈 이온수로 헹굽니다.
   1. 카세트 바닥에서 보호 테이프를 제거하고 젤 상단에서 빗을 제거합니다.
   2. 흐르는 버퍼(탈이온수에 1X로 희석)로 웰을 세 번 헹굽니다.
   3. 젤을 Mini-Cell에 넣고 카세트의 작은 면이 안쪽을 향하도록 합니다. 젤 텐션 웨지로 제자리에 고정하십시오. Mini-Cell을 사용하면 하나 또는 두 개의 젤을 병렬로 실행할 수 있습니다.
   4. 상단(내부) 챔버를 웰 수준보다 높은 1X 실행 버퍼로 채우고 누출이 있는지 확인합니다. 누출이 있는 경우 버퍼를 제거하고 젤의 위치를 변경합니다.
   5. 하부 챔버를 1X 러닝 버퍼로 채웁니다.
3. 하나의 웰에 10μL의 단백질 분자 마커를 로드합니다.
   1. 동일한 양의 겔 로딩 버퍼와 샘플을 혼합하고 젤 로딩 팁(각 샘플 간에 변경됨)을 사용하여 겔의 웰에 로드합니다. 이 웰에는 총 20μL까지 적재할 수 있습니다.
4. Mini-Cell에 뚜껑을 놓고 전극 코드를 전원 공급 장치에 연결합니다. 전원 공급 장치를 켜고 125분 동안 90V 일정으로 작동하도록 설정합니다. 하부 챔버의 와이어에 작은 기포가 형성되어 전류 순환을 나타내는지 확인하십시오.
5. 첫 번째 겔을 실행할 때 로딩 버퍼에 포함된 브로모페놀 블루를 지표로 사용하여 15분마다 마이그레이션 진행 상황을 모니터링합니다. 지시약 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 젤을 작동시킵니다.

2. 겔의 재생과 개발

1. 각 겔에 대해 1X 재생 완충액 100mL와 변성 완충액 200mL를 모두 탈이온수에 준비합니다.
2. 브로모페놀 블루 트래킹 염료가 젤 바닥에 닿으면 전원 공급 장치를 끄고 미니 셀을 연 다음 젤을 제거합니다. 젤 나이프(또는 계량 주걱)를 사용하여 카세트의 양면을 분리합니다. 젤의 방향을 표시하기 위해 모서리를 자릅니다.
3. 카세트에서 젤을 조심스럽게 제거하고 100mL 재생 완충액이 있는 용기에 넣습니다. 실온에서 30분 동안 부드럽게 저어 배양합니다.
4. 재생 완충액을 제거하고 현상 완충액 100mL를 겔에 추가합니다. 실온에서 30분 동안 부드럽게 저어 배양합니다.
5. 현상 완충액을 제거하고 현상 완충액 100mL를 겔에 더 첨가합니다. 37°C에서 하룻밤(16-18시간) 배양합니다.
6. 현상 완충액을 제거하고 실온에서 부드럽게 저어 탈이온수로 세 번(각 5분) 헹굽니다.
7. 겔을 스캔하여 단백질 표준 밴드의 정확한 위치를 저장하면 겔 염색 후 덜 보이거나 보이지 않게 됩니다.
8. 젤에 SimplyBlue Safestain 20mL를 추가하여 젤을 염색합니다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 저어 배양합니다.
9. SimplyBlue SafeStain을 제거하고 100mL 이상의 탈이온수에 젤을 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 저어주어 얼룩을 제거합니다.
10. 더 나은 결과를 얻으려면 깨끗한 탈이온수로 교체하고 실온에서 부드럽게 저어 한 시간 이상 더 배양하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Xcell SureLock Mini-Cell CE 마크 전기영동 장치	인비트로젠	EI0001
전원 공급 장치(모델 302)	폭스바겐	93000-744
Novex 10% 젤라틴 자이모그램 젤, 1.0mm, 12웰	인비트로젠	EC61752BOX
블루 주스 젤 로딩 버퍼	인비트로젠	10816015
젤 로딩 팁	폭스바겐	53509-015
단백질 분자량 표준	인비트로젠	LC5800
Novex 트리스-글리신-SDS 러닝 버퍼	인비트로젠	LC2675
Novex 자이모그램 재생 완충액	인비트로젠	LC2670
Novex 자이모그램 현상 완충액	인비트로젠	LC2671
심플블루 세이프스테인	인비트로젠	LC6060

년 년 시리즈 시리즈