Zymography Gel Electrophoresis: 효소 활성을 평가하여 기질 금속단백분해효소를 검출하는 전기영동 기법

초록

출처: Hu, X. et al., 자이모그래피에 의한 기능적 매트릭스 금속단백분해효소 검출. J. Vis. 특급 (2010년)

이 동영상은 세포 배양 상등액에 존재하는 기질 금속단백분해효소(MMP)의 활성을 평가하기 위한 자이모그래피 겔 전기영동 기술을 보여줍니다. 활성 MMP는 폴리아크릴아미드 겔에 내장된 MMP 특이적 기질을 분해하며, 이는 염색 후 어두운 염색된 배경에 대해 투명한 띠로 나타납니다.

프로토콜

1. 젤 로딩 및 실행

1. 모든 샘플은 효소의 기능을 유지하기 위해 적절하게 준비되어야 하며 채취 직후 사용하거나 -80°C에서 냉동 보관해야 합니다. 샘플에는 환원제(예: β-메르캅토에탄올)가 포함되어서는 안 되며 겔 로딩 전에 끓여서는 안 됩니다.
2. 카세트 내부의 젤이 들어있는 파우치를 열고 카세트를 탈 이온수로 헹굽니다.
   1. 카세트 바닥에서 보호 테이프를 제거하고 젤 상단에서 빗을 제거합니다.
   2. 흐르는 버퍼(탈이온수에 1X로 희석)로 웰을 세 번 헹굽니다.
   3. 젤을 Mini-Cell에 넣고 카세트의 작은 면이 안쪽을 향하도록 합니다. 젤 텐션 웨지로 제자리에 고정하십시오. Mini-Cell을 사용하면 하나 또는 두 개의 젤을 병렬로 실행할 수 있습니다.
   4. 상단(내부) 챔버를 웰 수준보다 높은 1X 실행 버퍼로 채우고 누출이 있는지 확인합니다. 누출이 있는 경우 버퍼를 제거하고 젤의 위치를 변경합니다.
   5. 하부 챔버를 1X 러닝 버퍼로 채웁니다.
3. 하나의 웰에 10μL의 단백질 분자 마커를 로드합니다.
   1. 동일한 양의 겔 로딩 버퍼와 샘플을 혼합하고 젤 로딩 팁(각 샘플 간에 변경됨....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Xcell SureLock Mini-Cell CE 마크 전기영동 장치	인비트로젠	EI0001
전원 공급 장치(모델 302)	폭스바겐	93000-744
Novex 10% 젤라틴 자이모그램 젤, 1.0mm, 12웰	인비트로젠	EC61752BOX
블루 주스 젤 로딩 버퍼	인비트로젠	10816015
젤 로딩 팁	폭스바겐	53509-015
단백질 분자량 표준	인비트로젠	LC5800
Novex 트리스-글리신-SDS 러닝 버퍼	인비트로젠	LC2675
Novex 자이모그램 재생 완충액	인비트로젠	LC2670
Novex 자이모그램 현상 완충액	인비트로젠	LC2671
심플블루 세이프스테인	인비트로젠	LC6060

년 년 시리즈 시리즈