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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 항원 접합 미세구의 제조
- 고유한 비드 영역을 가진 세 가지 다른 자기 마이크로스피어 바이알을 선택하고 사용된 각 바이알에 대한 비드 ID 및 로트 정보를 기록합니다.
메모: 각각의 고유한 미시구 영역에 대해 다음 단계를 따릅니다. 마이크로스피어는 빛에 민감하므로 빛에 장기간 노출되지 않도록 보호해야 합니다. 세척 단계 중에는 미세구를 방해하지 않도록 주의하십시오. 방해가 되면 두 번째 60초 간격을 두십시오.
- 60초 동안 마이크로스피어 스톡을 소용돌이치고 응집된 비드를 해리하기 위해 사용하기 전에 5분 동안 초음파 처리합니다.
- 1.0 x 106 비드를 1.5mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 튜브를 자기 분리기에 삽입하고 60초 동안 분리가 발생하도록 합니다. 튜브를 자기 분리기에 그대로 두고 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 100μL의 HPLC 등급 물로 비드를 다시 현탁시킨 다음 30초 동안 와류를 치십시오. 튜브를 자기 분리기에 다시 60초 동안 놓은 다음 상층액을 제거합니다. 이 세척 프로토콜을 두 번 반복합니다.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 세척된 미세구를 90μL의 100mM 일염기성 인산나트륨, pH 6.2(활성화 버퍼)에서 와류에 의해 30초 동안 재현탁합니다.
- 10 μL의 50 mg/mL Sulfo-NHS(활성화 버퍼로 희석됨)를 마이크로스피어에 추가하고 10초 동안 부드럽게 와류시킵니다. 10 μL의 50 mg/mL EDC 용액(활성화 버퍼로 희석됨)을 넣고 10초 동안 부드럽게 와류시킵니다. 실온(RT)에서 10분마다 부드러운 와류로 20분 동안 마이크로스피어를 배양합니다.
- LC/MS 등급 물 대신 50mM MES, pH 5.0(커플링 버퍼)으로 1.4-1.5단계 세척을 반복하여 총 2회 세척합니다.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 100μL의 커플 링 버퍼로 비드를 30 초 동안 와류로 재현 탁 한 다음 즉시 원하는 양의 단백질을 첨가합니다.
- 커플링 버퍼로 총 부피를 150 μL로 가져옵니다. 30초 동안 와류에 의한 커플링 반응을 혼합하고 RT.
에서 회전하여 2시간 동안 배양합니다.
메모: 본원에 정의된 분석의 경우, 다음과 같은 단백질 농도로 접합을 수행하였다: 스파이크 S1: 5 μg; 뉴클레오캡시드: 5 μg; 멤브레인 : 12.5 μg.
- LC/MS 등급의 물 대신 인산염 완충 식염수(PBS)-1% 염소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20(담금질 완충액)으로 세척 단계 1.4를 총 2회 세척합니다. 세척된 마이크로스피어를 30 s.
동안 와류에 의해 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 100μL의 담금질 완충액에 재현탁합니다.
메모: 다른 절차를 진행하기 전에 비드가 최소 6시간 동안 완전히 담금질되도록 하십시오.
- 자동화된 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 회수된 미세구의 수를 계산합니다. 관찰된 비드 농도를 기록합니다.
- 결합된 마이크로스피어를 어두운 곳에서 4°C에서 냉장 보관합니다.
2. 절차
- 분석 성능(기본 프로토콜)
- 30초 동안 소용돌이에 의해 결합된 미세구를 재현하고 ~60-90초 동안 초음파 처리합니다.
- 각 튜브에서 필요한 양의 각 비드 콜로이드를 제거하고 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 비드 콜로이드를 결합합니다.
- 튜브를 자기 분리기에 삽입하고 60초 동안 분리되도록 합니다. 튜브를 자기 분리기에 그대로 두고 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- 분리기에서 비드를 제거하고 100μL의 PBS-1% 소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20(분석 버퍼)으로 비드를 재현탁하고 30초 동안 와류를 재현탁합니다. 튜브를 자기 분리기에 넣고 60초 동안 분리가 발생하도록 합니다. 이 세척 프로토콜(즉, 2.1.3-2.1.4단계)을 두 번 반복합니다.
- 각 표적에 대해 1μL당 100 마이크로스피어의 최종 농도를 생성하기 위해 적절한 부피의 Assay Buffer를 추가하여 3-plex working microsphere mixture의 농도를 조정합니다.
- 단계 2.1.5에서 준비한 마이크로스피어 혼합물 12.5μL를 384웰 플레이트의 각 웰에 분취하거나 25μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다.
- 혈장/혈청 검체를 Assay Buffer에서 500배 희석합니다. 원하는 적정에 따라 표준 표본을 준비합니다.
- 12.5μL의 분석 버퍼를 블랭크 샘플로 추가하고 희석된 각 시료 또는 표준물질을 384웰 시료 플레이트의 지정된 각 웰에 추가하거나 25μL의 블랭크, 희석된 시료 또는 표준물질을 96웰 시료 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다
메모: 희석 곡선에 대한 개략도는 표 1에 나와 있습니다.
- 2.1.11단계에 명시된 대로 Assay Buffer를 사용하여 4μg/mL에서 항인간 검출 항체 용액(2차 항체 용액)을 준비합니다.
- Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) Conjugate 검출 항체를 4 μg/mL로 접합한 Goat-anti-human IgM을 준비합니다. 또는 4 μg/mL에서 Goat-anti-human IgM, SB Conjugate/ Goat-anti-human IgG, PE Conjugate 검출 항체를 준비합니다
메모: 384웰 플레이트 형식의 경우 12.5μL/웰의 2차 항체 용액이 필요하며, 96웰 플레이트 형식의 경우 25μL/웰이 필요합니다.
- 플레이트를 자기 분리기에 놓고 빠르게 세척한 다음 생물학적 위험 용기 위로 강제로 뒤집어 우물에서 액체를 제거합니다. 접시를 뒤집은 상태에서 두꺼운 종이 뭉치에 접시를 세게 두드립니다.
- 100μL의 분석 버퍼로 각 웰을 세척하고 앞서 설명한 대로 생물학적 위험 용기 위에서 강제로 반전하여 액체를 제거합니다. 이 단계(2.1.12-2.1.13)를 반복하여 총 두 번 세탁합니다. 사용한 모든 종이 뭉치는 생물학적 위험 용기에 버리십시오.
- 384웰 플레이트의 각 웰에 12.5μL의 2차 항체 작업 용액을 추가하거나 96웰 플레이트의 각 웰에 25μL를 추가합니다. 알루미늄 씰이나 호일로 플레이트를 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 세척 단계 2.1.12-2.1.13을 반복합니다.
- 384웰 플레이트의 각 웰에 75μL의 분석 버퍼를 추가하거나 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL를 추가합니다. 알루미늄 씰이나 호일로 플레이트를 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 RT로 5분 동안 배양합니다.
- 시스템 설명서에 따라 기기 분석기를 통해 60μL를 분석합니다.
표 1: 표준 곡선을 위한 희석 시리즈: IgG 혈청형을 위한 표준 곡선을 위해 이용된 희석 인자의 표; α-Spike S1 및 α-Nucleocapsid를 위한 1 μg/mL 및 α 막 항체를 위한 5 μg/mL에서 시작하는 7 점, 1:5 연속적인 희석 곡선으로 제시됩니다.
개
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개
개
개
호
개
호
호
개
명
호
명
| 규격 번호 | 희석 시리즈 | 스파이크 방지 S1 또는 N(μg/mL) | 멤브레인 방지(μg/mL) |
| 빈 | 빈 | - | - |
| 1 | 표준7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | 표준6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | 표준5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | 표준4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | 표준3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | 표준2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | 표준1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |