Multianalyte Immunobead Assay: 인간 혈청 샘플에서 여러 항체 아형을 동시에 검출하기 위한 흐름 기반 면역분석 기법

초록

출처: Fhied, C. L. et al., 코로나19에 대한 다중 분석 이뮤노비드 분석을 사용한 혈청전환의 동적 모니터링. J. Vis. 특급. (2022).

이 동영상은 서로 다른 항원과 결합된 형광 자기 구슬 또는 마이크로스피어를 사용하여 혈청 샘플에서 다양한 항체 동형을 동시에 검출하는 면역분석 기술에 대해 설명합니다. 이 분석은 감염 중 또는 백신 접종 후 혈청전환을 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 항원 접합 미세구의 제조

1. 고유한 비드 영역을 가진 세 가지 다른 자기 마이크로스피어 바이알을 선택하고 사용된 각 바이알에 대한 비드 ID 및 로트 정보를 기록합니다.
   메모: 각각의 고유한 미시구 영역에 대해 다음 단계를 따릅니다. 마이크로스피어는 빛에 민감하므로 빛에 장기간 노출되지 않도록 보호해야 합니다. 세척 단계 중에는 미세구를 방해하지 않도록 주의하십시오. 방해가 되면 두 번째 60초 간격을 두십시오.
2. 60초 동안 마이크로스피어 스톡을 소용돌이치고 응집된 비드를 해리하기 위해 사용하기 전에 5분 동안 초음파 처리합니다.
3. 1.0 x 10⁶ 비드를 1.5mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
4. 튜브를 자기 분리기에 삽입하고 60초 동안 분리가 발생하도록 합니다. 튜브를 자기 분리기에 그대로 두고 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
5. 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 100μL의 HPLC 등급 물로 비드를 다시 현탁시킨 다음 30초 동안 와류를 치십시오. 튜브를 자기 분리기에 다시 60초 동안 놓은 다음 상층액을 제거합니다. 이 세척 프로토콜을 두 번 반복합니다.
6. 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 세척된 미세구를 90μL의 100mM 일염기성 인산나트륨, pH 6.2(활성화 버퍼)에서 와류에 의해 30초 동안 재현탁합니다.
7. 10 μL의 50 mg/mL Sulfo-NHS(활성화 버퍼로 희석됨)를 마이크로스피어에 추가하고 10초 동안 부드럽게 와류시킵니다. 10 μL의 50 mg/mL EDC 용액(활성화 버퍼로 희석됨)을 넣고 10초 동안 부드럽게 와류시킵니다. 실온(RT)에서 10분마다 부드러운 와류로 20분 동안 마이크로스피어를 배양합니다.
8. LC/MS 등급 물 대신 50mM MES, pH 5.0(커플링 버퍼)으로 1.4-1.5단계 세척을 반복하여 총 2회 세척합니다.
9. 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 100μL의 커플 링 버퍼로 비드를 30 초 동안 와류로 재현 탁 한 다음 즉시 원하는 양의 단백질을 첨가합니다.
10. 커플링 버퍼로 총 부피를 150 μL로 가져옵니다. 30초 동안 와류에 의한 커플링 반응을 혼합하고 RT.
    에서 회전하여 2시간 동안 배양합니다. 메모: 본원에 정의된 분석의 경우, 다음과 같은 단백질 농도로 접합을 수행하였다: 스파이크 S1: 5 μg; 뉴클레오캡시드: 5 μg; 멤브레인 : 12.5 μg.
11. LC/MS 등급의 물 대신 인산염 완충 식염수(PBS)-1% 염소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20(담금질 완충액)으로 세척 단계 1.4를 총 2회 세척합니다. 세척된 마이크로스피어를 30 s.
    동안 와류에 의해 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 100μL의 담금질 완충액에 재현탁합니다. 메모: 다른 절차를 진행하기 전에 비드가 최소 6시간 동안 완전히 담금질되도록 하십시오.
12. 자동화된 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 회수된 미세구의 수를 계산합니다. 관찰된 비드 농도를 기록합니다.
13. 결합된 마이크로스피어를 어두운 곳에서 4°C에서 냉장 보관합니다.

2. 절차

1. 분석 성능(기본 프로토콜)
   1. 30초 동안 소용돌이에 의해 결합된 미세구를 재현하고 ~60-90초 동안 초음파 처리합니다.
   2. 각 튜브에서 필요한 양의 각 비드 콜로이드를 제거하고 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 비드 콜로이드를 결합합니다.
   3. 튜브를 자기 분리기에 삽입하고 60초 동안 분리되도록 합니다. 튜브를 자기 분리기에 그대로 두고 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
   4. 분리기에서 비드를 제거하고 100μL의 PBS-1% 소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20(분석 버퍼)으로 비드를 재현탁하고 30초 동안 와류를 재현탁합니다. 튜브를 자기 분리기에 넣고 60초 동안 분리가 발생하도록 합니다. 이 세척 프로토콜(즉, 2.1.3-2.1.4단계)을 두 번 반복합니다.
   5. 각 표적에 대해 1μL당 100 마이크로스피어의 최종 농도를 생성하기 위해 적절한 부피의 Assay Buffer를 추가하여 3-plex working microsphere mixture의 농도를 조정합니다.
   6. 단계 2.1.5에서 준비한 마이크로스피어 혼합물 12.5μL를 384웰 플레이트의 각 웰에 분취하거나 25μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다.
   7. 혈장/혈청 검체를 Assay Buffer에서 500배 희석합니다. 원하는 적정에 따라 표준 표본을 준비합니다.
   8. 12.5μL의 분석 버퍼를 블랭크 샘플로 추가하고 희석된 각 시료 또는 표준물질을 384웰 시료 플레이트의 지정된 각 웰에 추가하거나 25μL의 블랭크, 희석된 시료 또는 표준물질을 96웰 시료 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
   9. 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다
      메모: 희석 곡선에 대한 개략도는 표 1에 나와 있습니다.
   10. 2.1.11단계에 명시된 대로 Assay Buffer를 사용하여 4μg/mL에서 항인간 검출 항체 용액(2차 항체 용액)을 준비합니다.
   11. Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) Conjugate 검출 항체를 4 μg/mL로 접합한 Goat-anti-human IgM을 준비합니다. 또는 4 μg/mL에서 Goat-anti-human IgM, SB Conjugate/ Goat-anti-human IgG, PE Conjugate 검출 항체를 준비합니다
       메모: 384웰 플레이트 형식의 경우 12.5μL/웰의 2차 항체 용액이 필요하며, 96웰 플레이트 형식의 경우 25μL/웰이 필요합니다.
   12. 플레이트를 자기 분리기에 놓고 빠르게 세척한 다음 생물학적 위험 용기 위로 강제로 뒤집어 우물에서 액체를 제거합니다. 접시를 뒤집은 상태에서 두꺼운 종이 뭉치에 접시를 세게 두드립니다.
   13. 100μL의 분석 버퍼로 각 웰을 세척하고 앞서 설명한 대로 생물학적 위험 용기 위에서 강제로 반전하여 액체를 제거합니다. 이 단계(2.1.12-2.1.13)를 반복하여 총 두 번 세탁합니다. 사용한 모든 종이 뭉치는 생물학적 위험 용기에 버리십시오.
   14. 384웰 플레이트의 각 웰에 12.5μL의 2차 항체 작업 용액을 추가하거나 96웰 플레이트의 각 웰에 25μL를 추가합니다. 알루미늄 씰이나 호일로 플레이트를 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
   15. 세척 단계 2.1.12-2.1.13을 반복합니다.
   16. 384웰 플레이트의 각 웰에 75μL의 분석 버퍼를 추가하거나 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL를 추가합니다. 알루미늄 씰이나 호일로 플레이트를 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 RT로 5분 동안 배양합니다.
   17. 시스템 설명서에 따라 기기 분석기를 통해 60μL를 분석합니다.

표 1: 표준 곡선을 위한 희석 시리즈: IgG 혈청형을 위한 표준 곡선을 위해 이용된 희석 인자의 표; α-Spike S1 및 α-Nucleocapsid를 위한 1 μg/mL 및 α 막 항체를 위한 5 μg/mL에서 시작하는 7 점, 1:5 연속적인 희석 곡선으로 제시됩니다.

개 개 개 개 개 호 개 호 호 개 명 호 명

규격 번호	희석 시리즈	스파이크 방지 S1 또는 N(μg/mL)	멤브레인 방지(μg/mL)
빈	빈	-	-
1	표준7 1:1	1	5
2	표준6 1:5	0.2	1
3	표준5 1:25	0.04	0.2
4	표준4 1:125	0.008	0.04
5	표준3 1:625	0.0016	0.008
6	표준2 1:3125	0.00032	0.0016
7	표준1 1:15625	0.000064	0.00032

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
384웰 블랙 사이드 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트	써모 피셔	전화 12-565-346
활성화 완충액(0.1M NaH2PO4, pH 6.2)	집에서 준비
분석 완충액(PBS, 1% 소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20)	집에서 준비
소 혈청 알부민, 열 충격 분율	밀리포어시그마	A-7888-50G
커플링 버퍼(50mM MES, pH 5.0)	집에서 준비
COVID 19 M 코로나바이러스 재조합 매트릭스 단백질(6xHistag)	마이바이오소스	MBS8574735
일회용 피펫 팁
EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염)	써모 피셔	PIA35391
염소 알부민, 분획 V 분말	밀리포어 시그마	A2514-1지
IgA 염소 안티 휴먼, R-PE, 폴리 클로나	써모 피셔	OB205009
IgG 염소 안티 휴먼, R-PE, 다클론성	써모 피셔	OB204009
IgG 염소 항토끼, R-PE, 다클론성	써모 피셔	OB403009
gM 염소 안티 휴먼, R-PE, 다클론	써모 피셔	OB202009
IgM 마우스 안티 휴먼, SB 436, 클론 SA-DA4	써모 피셔	62999842
기기 분석기	Luminex 공사	인텔리플렉스-루오
Low-Bind 마이크로 원심분리기 튜브(1.5 mL)	써모 피셔	13-698-794
MagPlex-C 마이크로스피어, Region XXX	Luminex 공사	MC10XXX-01
MES 수화물(2-(N-Morpholino)에탄 설폰산 수화물)	밀리포어시그마	M2933
마이크로플레이트 알루미늄 밀봉 테이프	써모 피셔	전화: 07-200-683
폴리소르베이트-20	써모 피셔	BP337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2	써모 피셔	50-751-7328
담금질 완충액 (PBS, 1% 염소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20)	집에서 준비
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 뉴클레오캡시드 단백질(His 태그)	Sino Biologicals (중국생물학제)	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 단백질(S1 소단위체, His 태그)	Sino Biologicals (중국생물학제)	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 RBD 항체, Rabbit pAb	Sino Biologicals (중국생물학제)	40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 뉴클레오캡시드 항체, 토끼 mAb	Sino Biologicals (중국생물학제)	제40588-R0004
SARS-CoV-2 (COVID-19) 막 항체 (IN), Rabbit pAb	프로사이	10-516
설포-NHS(N-하이드록시설포숙신이미드)	써모 피셔	PIA39269
세척액 (PBS, 0.01% 폴리소르베이트-20)	집에서 준비
물, LC/MS 등급	써모 피셔	승-64

호 년