Phospholipase Activity Assay: Anthopleura dowii 의 조독 추출물에서 Phospholipase 활성을 결정하기 위한 겔 확산 분석

초록

출처: Ramírez-Carreto, S., et al., Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays. J. Vis. 특급. (2022년)

이 비디오에서는 해양 말미잘인 Anthopleura dowii의 조독 추출물에서 포스포리파아제의 존재를 확인하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 효소 포스포리파아제(Enzyme phospholipase)가 방사형 방식으로 고체 매체에 통합된 인지질을 확산시키고 분해하는 아가로스 겔 확산 기술을 사용합니다.

프로토콜

1. 유기체 수집

1. 말미잘(seamone) A. dowii.
   채취 참고: 여기에서 유기체는 멕시코 캘리포니아주 엔세나다 바하(Ensenada Baja) 해안의 조간대에서 썰물 기간 동안 수집되었습니다(그림 1A, B). 
2. 유기체를 바닷물이 담긴 용기에 담아 실험실로 운반합니다(그림 1C).
3. 실험실에서는 증류수로 유기체를 손으로 세척하여 신체에 부착 된 큰 기질 입자를 제거합니다.
4. 즉시 유기체를 -80 ° C의 초 냉동고에서 72 시간 동안 동결합니다.
5. 동결 건조를 위해 유기체를 -20 ° C, 0.015 psi, 48 시간 동안 동결 건조 조건으로 특수 유리에 넣으십시오.
6. 동결건조된 유기체는 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.

2. 조직 수분 공급

1. 동결건조된 유기체의 건조 중량 20g을 50mM 인산나트륨 완충액 60mL(1/3 w/v), pH 7.5 및 억제제 칵테일 정제 1정으로 재구성합니다(재료 표).
2. 자기 교반기에서 샘플을 ~800rpm, 4°C에서 12시간 동안 계속 교반합니다.

3. 독소 방출

1. 세포 용해 및 선낭 방전을 유도하려면 샘플을 -20°C에서 12시간 동안 동결한 다음 용기를 실온(RT)의 물에 넣어 최대 90%까지 해동할 때까지 합니다. 이 절차를 세 번 반복합니다.
   메모: 샘플은 100% 해동되지 않습니다. 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플을 ~4°C로 유지하는 것이 중요합니다.
2. 컨포칼 현미경으로 배출된 선낭을 관찰합니다. 슬라이드에서 샘플 10μL를 취하고 그 위에 커버슬립을 놓습니다. 컨포칼 현미경으로 100x 및 60x 배율로 관찰합니다. 여기에는 염료가 필요하지 않았습니다.
3. 컨포칼 현미경으로 캡처한 이미지를 ImageJ 소프트웨어(버전 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij)에서 처리합니다.
4. 선충 내부의 세뇨관이 풀려 밖에 있으면 선충이 방전됩니다. 그런 다음 다음 단계를 계속합니다. 그렇지 않으면 동결-해동 주기만 한 번만 더 수행하십시오.
5. 추출물을 명확히 하기 위해 25,400 x g에서 40분, 4°C 동안 샘플을 원심분리하고 상층액을 회수한 다음 다시 원심분리합니다. 이 단계를 3-4회 반복합니다.
6. 상등액을 회수하고 펠릿을 버립니다. 상층액 또는 미처리 추출물에는 독 성분(독소)과 지질, 탄수화물 및 핵산과 같은 기타 세포 분자가 포함되어 있습니다.

4. 총 단백질의 정량

분석

1. 상용 Bradford 비색 분석 키트(Table of Materials)를 사용하여 미처리 추출물의 단백질 농도를 측정합니다.
2. 염료 시약을 희석합니다(염료 1부와 증류수 4부).
3. 인산염 완충액(50mM 인산나트륨, pH 7.5)에서 1mg/mL 농도의 소 혈청 알부민(BSA) 분획 V(재료 표) 용액을 준비합니다.
4. 표 1에 나열된 솔루션을 세 번에 걸쳐 준비합니다.
5. 각 용액을 셰이커에 넣고 4초 동안 세게 섞습니다.
6. 흔들지 않고 RT에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
7. 595nm에서 흡광도(AU)를 측정합니다.
8. 표본 BSA 흡광도의 평균(AU 대 단백질 농도)을 도표화하고 그래프의 방정식(방정식 1)을 결정합니다
   
   여기서 y는 흡광도, m은 선의 기울기, x는 단백질 농도, b는 y절편입니다. 미처리 추출물 농도를 계산하려면 다음과 같이 x를 구합니다.
   

5. 폴리펩티드 독 복잡성 확인

1. 설명서에 따라 수직 젤 전기 이동법을 위한 유리제 콘테이너를 조립하십시오.
2. 아크릴아미드 혼합물 준비(30%): 아크릴아미드 29.2g, 비스-아크릴아미드 0.8g, 최종 부피 100mL. 0.45μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과합니다. 용액을 4°C의 어두운 병에 보관하십시오. 그런 다음 분해 겔에 대한 혼합물을 준비합니다(표 2).
3. SDS-PAGE 젤은 분해 젤과 스태킹 젤로 구성됩니다. 표 2에 정의된 용액 부피에 따라 겔을 준비합니다. 준비하는 동안 중합 시간을 줄이기 위해 각 혼합물을 4°C로 유지해야 합니다.
   메모: 각 혼합물의 부피는 사용되는 장비 브랜드에 따라 다릅니다. 이 프로토콜의 경우, 부피는 수직 전기영동 챔버를 위한 0.75mm 두께의 15% 아크릴아미드 겔의 제조에 해당합니다(재료 표).
4. 아크릴아미드가 중합된 후, ~10분, 스태킹 젤의 혼합물을 첨가합니다.
5. 스태킹 젤을 위한 혼합물을 준비하고 즉시 유리판에 첨가하고 빗을 놓아 샘플을 적재하기 위한 웰을 형성합니다.
6. 스태킹 겔이 중합되면(~15분) 빗을 제거하고 수직 전기영동을 위해 유리 용기를 챔버에 넣습니다.
7. 전극 완충액 200mL(0.25M Tris, 0.192M 글리신, 0.1% SDS)를 전기영동 챔버에 넣습니다.
8. 미처리 추출물 분석: 미처리 추출물 30μg과 단백질 로딩 버퍼 5μL(25% 글리세롤, 15% 도데실황산나트륨, 25% 2-메르캅토에탄올, 0.125mM Tris pH 7, 브로모페놀 블루 0.1mg/mL)를 혼합하여 단백질을 변성시킵니다. 최종 부피는 <50μL여야 합니다.
9. 90°C에서 5분간 가열한 후 식힌 다음 1,400 x g에서 3초 동안 원심분리합니다. 10. 스태킹 겔의 웰에 샘플을 로드합니다. 표준 분자량 ladder를 로드합니다.
10. 스태킹 젤의 웰에 샘플을 로드합니다. 표준 분자량 ladder를 로드합니다.
11. 25mA 상수에서 1시간 30분 동안 전기영동을 실행합니다.
12. 전기영동 챔버에서 유리 용기를 제거하여 겔 단백질의 염색을 진행합니다.

6. 단백질 염색

1. 50mL의 증류수로 겔을 헹구어 버퍼 전극에서 이물질을 제거합니다.
2. 물을 버리십시오.
3. 겔 단백질의 확산을 피하기 위해 고정 용액 (에탄올 60mL, 아세트산 20mL, 증류수 20mL, 최종 부피 100mL)을 첨가하십시오. 80rpm으로 흔들면서 40분 동안 RT에서 배양합니다. 용액을 디캔팅하십시오.
4. 단백질 가교 용액(에탄올 15mL, 글루타르알데히드 0.25mL, 증류수 50mL, 최종 부피 65.25mL)을 추가하고 80rpm으로 진탕하면서 RT에서 30분 동안 배양합니다. 용액을 제거합니다.
5. 증류수 100mL로 젤을 5분 동안 씻고 물기를 제거합니다. 이 절차를 네 번 반복합니다.
6. 50mL의 Coomassie brilliant blue R-250 여과 용액(40% 메탄올, 10% 아세트산, 50% 증류수, 0.1% 염료, 최종 부피 100mL)으로 단백질 염색을 수행하고 실험실 회전 발진기에서 60rpm으로 15분 동안 교반합니다.
7. 다른 젤을 염색하는 데 사용할 수 있는 용액을 회수합니다.
8. 과도한 염료를 제거하려면 탈색 용액 (메탄올 40mL, 아세트산 10mL, 증류수 50mL)을 첨가하십시오. 밴드(염색된 단백질)가 시각화될 때까지 RT에서 계속 저어줍니다(80rpm).
9. 겔을 50mL의 증류수에 보관하고 겔 문서화 시스템에서 이미지를 스캔합니다.

7. 포스포리파제 분석

1. 증류수에 1% SDS가 함유된 달걀 1개를 씻으십시오.
2. 멸균 상태에서 달걀 흰자에서 달걀 노른자를 분리하십시오.
3. 0.86% NaCl 용액 50mL를 준비하고 0.22μm 필터를 통해 여과합니다. 그런 다음 용액 A를 준비합니다: 달걀 노른자 12mL와 0.86% NaCl 용액 36mL를 추가합니다.
4. 용액 B 준비: 50mL의 완충액(50mM Tris, pH 7.5)에 300mg의 아가로스를 혼합하고 0.22μm 필터를 통해 여과합니다. 끓을 때까지 전자 레인지에서 용액을 가열하십시오. 43-45°C가 될 때까지 따뜻한 물에 식힙니다.
5. 용액 C 준비: 10mM CaCl2를 준비하고 0.22μm 필터로 여과합니다.
6. 용액 D 준비 : 증류수 1mL에 로다 민 6G 10mg
.
7. 멸균 조건(층류 후드)에서 용액 A 및 C 500μL를 용액 B에 추가하고 용액 D 100μL를 첨가한 후 25mL를 혼합하여 각 페트리 접시(90 x 15mm)에
붓습니다.
8. 용액이 멸균 상태(30분)에서 응고될 때까지 기다립니다.
9. 얇은 튜브로 우물(직경 ~2-3mm)을 만듭니다.
10. 한 웰에 총 20μL의 인산염 완충액(음성 대조군)을 추가하고 다른 웰에 결정된 포스포리파제(양성 대조군) 20μL를 추가합니다.
11. 나머지 웰에 서로 다른 양의 미처리 추출물 단백질 5, 15, 25, 35, 45 μg을 각각 20 μL의 최종 부피로 놓습니다.
12. 한천이 모든 샘플을 흡착할 때까지 기다립니다(30분).
13. 37 ° C에서 20 시간 동안 배양하십시오.
14. 우물 주위에 후광이 형성되면 포스포리파제 활성을 나타냅니다. 버니어 캘리퍼스로 형성된 후광을 측정합니다.
    메모: 실험을 세 번씩 수행합니다(7.1-7.14의 단계).

결과

그림 1: 말미잘 채취. (A) 멕시코 바하 칼리포르니아 노르테주 엘 사우잘의 조간대. (B) 말미잘을 채취한 경우. (C) Anthopleura dowii Verrill, 1869년.

표 1: Bradford 분석에 의한 단백질 정량화.

튜브

증류수

BSA

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브	코 닝	430766
2-브로모페놀 블루	시그마	B75808
2-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M6250-100ML
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	코 닝	430828
아세트산 빙하	J.T. 베이커	9515-03
아크릴아마이드	프로메가	V3115
아가로스	프로메가	V3125
비사아크릴아미드	프로메가	V3143
소 혈청 알부민 분획 V	시그마	A3059-100G
Bradford 단백질 어세이	바이오 라드	5000006
염화칼슘	시그마-알드리치	C3306 (영문
세포 배양 플레이트 96 웰, V-바닥	코 닝	3894
원심 분리기	에펜도르프	5804R
원심분리기 튜브	코 닝	CLS430829
ChemiDoc MP 시스템	바이오 라드	1708280
구연산	시그마-알드리치	251275
Clear flat.bottom 96-웰 플레이트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	3855
쿠마시 브릴리언트 블루 G-250	바이오 라드	#1610406
쿠마시 브릴리언트 블루 R-250	바이오 라드	1610400
포도당	J.T. 베이커	1916-01
덕트리스 인클로저	랩콘코	세로	https://imagej.nih.gov/ij 이미지J 1.53c
젤 독 이지	바이오 라드.		겔 문서화 시스템
글리세롤	시그마-알드리치	G5516-4L
혈구계	마리엔펠트	650030
ImageJ(소프트웨어)	NIH, 미국	버전 1.53c
인큐베이터 211	랩넷	I5211 DS
메탄올	J.T. 베이커	9049-03
Mini-PROTEAN 테트라 셀	바이오 라드	1658000EDU
나2HPO4	J.T. 베이커	3824-01
염화나트륨	J.T. 베이커	3624-01
나H2PO4.H2O	J.T. 베이커	3818-05
Origin 소프트웨어		버전 9	시그모이드 조정을 사용하여 플롯을 설계하려면
페트리디쉬	송골매	351007
피펫맨 키트	길슨	F167380
프리캐스트 미니 젤	바이오라드	1658004
Prestained Protein Ladder (단백질 래더	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	26620
프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11836153001
단백질 분석 염료 시약 농축액	바이오 라드	5000006
로다 민 6G	시그마-알드리치	252433
증권 시세	시그마-알드리치	L4509
구연산나트륨 이수화물	JT 베이커	3646-01
분광 광도계	써모사이언티픽	G10S 자외선-광
트리스 베이스	시그마-알드리치	77-86-1
볼트 전원 공급 장치	회퍼	PS300B