고리 모양의 미세패터닝 세포 키랄성 분석: 고리 모양의 미세패턴에서 세포 정렬을 기반으로 다세포 키랄성을 결정하는 시험관 내 기술

초록

출처: Zhang, H. et al. 세포 키랄성 측정을 위한 마이크로패터닝 분석. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오에서는 고리 마이크로패턴과 같은 제한된 기하학적 경계에 있는 세포의 정렬 편향을 결정하기 위한 세포 키랄성 분석에 대해 설명합니다. 키랄성은 대부분의 세포 유형에 내재된 특성이며 유전적 및 환경적 요인에 의해 결정됩니다. 정상 세포 집단의 키랄성을 알면 약물 처리된 세포를 스크리닝하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 우표 제작

1. CAD 소프트웨어를 사용하여 내경이 250μm이고 외경이 450μm인 미세한 고리 배열을 그립니다. 이 프로토콜에 사용되는 패턴은 링 사이의 거리가 850μm인 10 x 10 어레이입니다.
2. 미세 가공 회사의 마스크 인쇄 서비스를 사용하여 원하는 해상도로 패턴의 투명 마스크를 인쇄합니다(재료 표 참조).
   메모: 제공된 고리 치수는 많은 세포 유형에 대해 작동하는 것으로 입증되었습니다.
3. 네거티브 포토레지스트 몰드(예: SU-8)를 만들기 위해 원하는 특징이 포함된 마스크를 사용하여 자외선(UV) 포토리소그래피를 수행합니다.
   1. 1.1-1.2 단계에서 제작된 투명 마스크로 포토레지스트로 스핀 코팅된 실리콘 웨이퍼를 덮습니다.
   2. UV 접촉 정렬기에서 UV 광선에 의해 마스크의 투명 영역 아래에서 포토레지스트를 중합합니다.
      메모: 추가 세척 및 개발 후 원하는 기능을 갖춘 마스터 금형이 제작됩니다. 운영 세부 사항은 사용하는 특정 장비에 따라 다릅니다.
4. PDMS 엘라스토머 프리폴리머를 경화제와 10:1 비율로 혼합하여 준비한 다음 혼합물을 페트리 접시의 금형에 주조합니다.
5. 접시를 진공 챔버에 30분 동안 넣어 PDMS의 기포를 제거하고 60°C의 오븐에서 최소 2시간 동안 굽습니다.
6. PDMS의 경화가 완료된 후 패턴 배열을 스탬프로 자릅니다.
   메모: 더 두꺼운 스탬프(약 1cm)는 마이크로 접촉 인쇄의 이후 단계에서 취급이 용이하기 때문에 선호될 수 있습니다.

2. 유리 슬라이드 코팅

1. 유리 슬라이드를 청소합니다. 슬라이드를 100% 에탄올 수조에 담그고 5분 동안 초음파 처리한 다음 물로 헹굽니다.
2. 이 단계를 먼저 아세톤으로 반복한 다음 이소프로판올로 반복한 다음 질소 흐름에서 건조시킵니다.
3. 전자빔(E-beam) 증발 장비를 사용하여 유리 슬라이드에 티타늄 및 금 층을 코팅합니다.
   메모: 티타늄 층의 경우 원하는 두께는 15 Å (1 Å = 10-10 m)입니다. 금층의 경우 원하는 두께는 150 Å입니다. 티타늄을 먼저 코팅한 다음 금을 코팅하면 티타늄 층이 금과 유리 슬라이드 사이의 접착제 역할을 합니다.
4. 청소한 슬라이드를 증발 챔버에 넣고 셔터 아래에 금과 티타늄 도가니를 삽입합니다.
5. 금속을 녹이기 전에 10-5 Pa 미만의 진공을 생성하기 위해 챔버를 펌핑합니다. 전자빔을 금속에 초점을 맞추고 증착 속도가 증착 두께를 제어하는 데 적합하도록 출력을 조정합니다.
6. 셔터를 열어 금속 증착을 시작합니다. 원하는 두께에 도달하면 셔터를 닫습니다.
7. 두 금속의 순차적 증발 사이에서 도가니를 전환합니다.
8. 장비의 필요에 따라 도가니가 식을 때까지 기다렸다가 챔버를 환기시키고 금으로 코팅된 유리 슬라이드를 꺼냅니다.
9. 장비 유지 보수를 위해 챔버를 다시 펌프로 펌핑합니다.
   메모: 작동 세부 사항은 특정 E-beam 증발기에 따라 달라질 수 있습니다. 티타늄의 잘 제어되고 낮은 증착 속도를 갖는 것이 중요합니다. 두꺼운 티타늄 층은 특히 세포의 형광 이미징에서 가시성을 떨어뜨리는 경우가 많습니다. 코팅 후 티타늄/금으로 코팅된 유리 슬라이드는 실온의 건조 진공 챔버에 최소 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. 마이크로 컨택트 인쇄

1. 원하는 경우 티타늄/골드 코팅 슬라이드를 더 작은 조각으로 자릅니다. 일반적인 응용 분야에는 12mm x 12mm의 정사각형 모양이 권장됩니다(그림 1B).
2. 유리 절단기를 사용하여 표면을 가로질러 미끄러져 움푹 들어간 트랙을 남긴 다음 유리 슬라이드를 양쪽에서 잡고 움푹 들어간 부분을 구부려 작은 부분으로 나눕니다. 금으로 코팅된 표면을 만지지 마십시오.
   메모: 우발적으로 넘어진 경우 유리의 어느 면이 코팅된 표면인지 시각적으로 확인하려면 양쪽의 빛 반사를 비교하십시오. 금으로 덮인 표면은 더 밝은 반사를 보이는 반면, 코팅되지 않은 면은 더 어두운 반사를 보입니다(유리 반대쪽의 티타늄 층으로부터). 다른 방법은 슬라이드의 가장자리를 관찰하는 것이며 코팅 측면은 수직 절단 표면에서 결정할 수 있습니다.
3. 페트리 접시에 100% 에탄올을 담그고 금색 면이 위로 향하게 하여 궤도 셰이커에 최소 10분 동안 담가 슬라이드를 청소합니다. 에탄올을 흡입한 다음 질소 흐름으로 불어 각 슬라이드를 건조시킵니다.
4. PDMS 스탬프를 비눗물과 100% 에탄올로 세척합니다. 질소 가스로 스탬프를 말리십시오.
5. 100% 에탄올 10mL에 C18 분말 5.74mg을 용해하여 2mM 옥타데칸네티올(C18) 용액을 준비합니다.
   메모: C18 용액을 밀봉하여 실온에서 보관하십시오. C18로 패턴을 프린팅하면 피브로넥틴과 세포가 우선적으로 부착되는 접착식 자체 조립 단층이 생성됩니다.
6. 패턴이 있는 표면이 아래를 향하도록 하여 PDMS 스탬프를 C18 용액에 10초 동안 담그고 질소 가스로 60초 동안 부드럽게 건조시킵니다.
   메모: 건조할 때 대부분의 액체가 증발할 때까지 스트림을 먼저 스탬프에서 멀리 떨어뜨리고(약 1m) 스트림을 천천히 더 가깝게 이동하여 스탬프를 완전히 건조시킵니다. 이것은 C18 용액이 스탬프에서 건조되는 대신 날아가는 것을 방지하기 위한 것입니다.
7. 제거하기 전에 60초 동안 스탬프를 금 슬라이드에 뒤집어 놓습니다.
8. 적절한 스탬핑을 위해 핀셋을 스탬프에 부드럽게 두드려 패턴을 적절하게 전사합니다. 너무 세게 누르지 마십시오. 핀셋의 무게는 일반적으로 충분합니다.
   메모: 두드리는 동안 스탬프를 육안으로 검사하면 스탬프와 유리 슬라이드가 균일하게 접촉했는지 확인할
수 있습니다.
9. 습도 챔버를 준비하십시오.
   1. 70% 에탄올 1mL를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 피펫팅하고 파라필름 조각을 올려 표면을 덮습니다(앞면이 위로 향하게 덮음).
   2. 핀셋을 사용하여 들어 올리고, 기포가 없도록 파라필름을 깔고, 필요한 경우 과도한 에탄올을 제거합니다.
10. 2mM HS-(CH2)11-EG3-OH(EG3) 용액 준비: 5μL 원액을 100% 에탄올 5mL에 희석합니다.
    메모: 희석된 EG3 용액은 밀봉하여 4°C에서 보관할 수 있으며 희석되지 않은 EG3 원액은 -20°C에서 보관해야 합니다. EG3 처리는 C18이 없는 유리 영역을 세포에 비접착식으로 만드는 데 사용됩니다.
11. 각 쿼터 글라스에 대한 EG3의 마이크로피펫 40μL 방울이 습도 챔버의 파라필름으로 미끄러져 들어가 방울 사이에 금 슬라이드의 간격을 설명할 수 있는 충분한 공간을 남깁니다.
12. 핀셋을 사용하여 C18 인쇄 금색 슬라이드를 아래로 향하게 하여 액적 위에 놓고 슬라이드 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 증발을 최소화하기 위해 슬라이드를 들어 올리지 않고 부드럽게 밀어 넣습니다.
    메모: 유리 슬라이드의 한쪽 가장자리를 물방울 근처에 놓고 유리 슬라이드의 다른 쪽 끝을 천천히 내립니다. 거품이 있으면 거품이 더 이상 존재하지 않을 때까지 골드 슬라이드를 들어 올리지 않고 밉니다.
13. 페트리 접시를 파라필름으로 단단히 밀봉하고 최소 3시간 동안 실온에 두십시오.
    메모: 광범위한 배양을 원하는 경우 페트리 접시를 이중 밀봉하고 최대 24시간 동안 그대로 두십시오.
14. 생물 안전 캐비닛에서 페트리 접시에 금 슬라이드를 앞면이 위로 향하게 놓고 70% 에탄올에 3회 담그고 헹궈 EG3를 제거한 다음 살균을 위해 에탄올에 10분 동안 그대로 둡니다.
15. 에탄올을 흡입하고 멸균 PBS로 교체하십시오.
16. 3.9단계에서 설명한 대로 에탄올 대신 PBS를 사용하여 다른 습도 챔버를 준비합니다.
    메모: 표면 장력의 차이로 인해 먼저 4-5mL의 PBS를 첨가하여 파라필름을 놓고 기포를 제거한 다음 초과분을 흡인하는 것이 더 쉽습니다.
17. 멸균 PBS에 50μg/mL 피브로넥틴 용액(원하는 경우 다른 단백질)을 준비하고 각 쿼터마다 50μL의 피브로넥틴 용액 방울을 파라필름에 밀어 넣고 방울 사이에 약간의 공간을 남겨둡니다.
    메모: 피브로넥틴 코팅은 패턴이 있는 표면에 대한 세포 접착을 용이하게 합니다.
18. 웨이퍼 핀셋을 사용하여 슬라이드를 액적 위에 앞면이 아래로 향하게 놓고 슬라이드 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 슬라이드를 들어 올리지 않고 부드럽게 밀어 넣습니다.
    메모: 유리 슬라이드 핀셋 또는 팁이 직선으로 넓은 웨이퍼 핀셋이 슬라이드 취급을 위해 권장됩니다.
19. 페트리 접시를 생물 안전 캐비닛에 30분 동안 그대로 두십시오.
20. 30분 후 3회 헹군 후 PBS에 금 슬라이드를 앞면이 위로 향하게 놓습니다.
    메모: 피브로넥틴 패턴 슬라이드는 약 한 달 동안 4°C의 PBS에 보관할 수 있습니다.

4. 미세 패턴 슬라이드에 세포 파딩

1. 세포 배양 배지와 트립신을 37°C 수조에서 예열합니다.
   메모: 이하 subculture에 대한 설명은 NIH/3T3 세포에 대한 것입니다. 배양 조건은 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다.
2. (선택 사항) 패턴이 있는 슬라이드를 12웰 플레이트의 배양 배지에 담그고, 세포의 트립신화 전에 인큐베이터에서 37°C까지 예열하여 세포 부착을 개선합니다.
3. 세포를 트립신화하고, FBS 함유 배지로 중화하고, 100 x g에서 3분 동안 원심분리한 다음 새로운 배지와 잘 혼합하여 재현탁합니다.
   메모: 세포가 서로 완전히 분리되어 있는지 확인합니다.
4. 세포를 계수하고 200,000 cells/mL로 희석한 다음 하나의 금 슬라이드를 포함하는 각 웰에 0.5mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
5. 균일한 세포 파종을 위해 웰 플레이트를 몇 번 부드럽게 흔들고 세포가 부착될 수 있도록 15분 동안 인큐베이터에 보관합니다.
6. 15분 후 현미경으로 세포 부착을 확인합니다. 필요한 경우 추가 시간을 허용합니다.
   메모: 부착된 세포는 눈에 띄는 필로포듐 또는 평탄화와 함께 표면에 퍼지며 웰 플레이트를 부드럽게 두드리거나 이동할 때 표면에서 움직이지 않습니다.
7. 각 웰에서 부착되지 않은 세포가 포함된 배지를 흡입하고 1mL의 배양 배지를 추가합니다. 약물 치료를 위해 이 단계에서 배양 배지에 추가 시약을 보충합니다.
8. 인큐베이터에서 세포를 24시간 동안 배양하고 포화도를 확인하여 키랄성이 형성되었는지 확인합니다.
   메모: 대부분의 세포 유형에는 75% 이상의 포화도가 권장되며, 과도한 포화도는 키랄성 특성화에 영향을 미칠 수 있습니다.

5. 이미지 모음

1. 컨플루언시 세포를 고정하십시오.
   1. 웰 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 한 번 헹굽니다.
   2. 4% 파라포름알데히드 용액을 넣고 실온에서 15분 동안 배양한 다음 PBS로 3번 헹굽니다.
      참고: 고정으로 인해 세포 형태가 크게 변하는 경우, 고정 전에 이미징하는 것이 권장됩니다.
2. 카메라 기능이 있는 위상차 현미경을 사용하여 슬라이드의 각 링을 고해상도로 이미지화합니다(10x 대물 렌즈는 분석에 충분합니다).

6. 세포 키랄성 특성화(그림 2)

1. 키랄성 특성화를 위한 MATLAB 코드 파일을 다운로드할 수 있습니다.
2. 코드 폴더와 하위 폴더(내부에 순환 통계 도구 상자 포함)를 MATLAB 경로에 추가하고 "ROI_selection.m" 파일을 엽니다. 4행에서 디렉토리를 원하는 데이터 폴더로 변경합니다(창 사용자의 경우 4행과 5행에서 "/"를 "\"로 전환).
3. 14행의 이미지 크기를 변경하되, 처음 두 숫자는 링의 안쪽 원 크기를 나타내고 다른 두 숫자는 바깥쪽 원을 나타냅니다.
   메모: 분석할 폴더에 있는 모든 이미지의 크기가 동일한지 확인합니다.
4. 실행 버튼을 클릭하고 MATLAB 코드 "ROI_selection.m"을 실행하여 위상차 이미지에서 관심 영역(ROI)을 확인합니다.
5. 선택 사각형을 링에 맞게 수동으로 드래그한 다음 이미지를 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다.
6. 폴더의 모든 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다(이전 이미지의 ROI 선택을 확인한 후 다음 이미지가 자동으로 팝업됨). 각 이미지에 대한 ROI 정보를 저장하기 위해 ".mat" 파일이 생성됩니다.
7. "Analysis_batch.m" 파일을 열고 6.2단계와 동일하게 폴더의 디렉토리를 변경합니다. (윈도우 사용자의 경우 처음 사용하는 경우 5, 6, 124, 130행에서 "/"를 "\"로 전환
)
8. 실행 버튼을 클릭하여 코드 "Analysis_batch.m"을 실행하여 여러 세포 고리 패턴의 키랄성을 확인합니다. 각 고리에 대한 순환 통계와 시계 방향, 비카이랄 및 시계 반대 방향 고리의 수를 포함하는 "datatoexcel.txt" 파일이 생성됩니다.

결과

그림 1. 세포 마이크로 패터닝의 개략도. (A) 세포 패터닝을 위한 미세 가공 및 미세 접촉 인쇄의 절차. 네거티브 포토레지스트 몰드는 마이크로 패터닝 특징(1-2)을 포함하는 마스크를 통해 포토레지스트의 자외선(UV) 가교에 의해 만들어졌습니다. 폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머 프리폴리머를 금형에 주조하여 스탬프(3-4)를 생성했습니다. 그런 다음 접착 자체 조립 단층(SAM), 옥타-데칸티올(C18)을 스탬프에 코팅하고 마이크로 컨택 인쇄(5-7)를 통해 금으로 코팅된 유리 슬라이드에 전사한 다음 비접착 에틸렌 글리콜 말단 SAM, HS-(CH2)11-EG3(EG3)(8) 및 피브로넥틴(9)을 코팅했습니다. 그런 다음 세포를 파종하여 패턴(10)에 부착했습니다. (...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
200 프루프 에탄올	코프텍	DSP-MD-43
BZX 현미경 시스템	키엔스	비ZX-600
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM), 고포도	지브코	11965092
전자빔 증발기	템스칼	BJD-1800	금-티타늄 필름 코팅
소 태아 세럼	폭스바겐	89510-186
소 혈장에서 추출한 피브로넥틴	시그마	F1141-5MG
유리 현미경 슬라이드	폭스바겐	제10024-048
유리 핀셋	엑셀타	390BSAPI
금 증발 펠릿	국제 고급 재료	호주18
HS- (CH2) 11-EG3-OH (EG3)	프로키미아	토륨 001-m11.n3-0.2
MATLAB을	매스웍스	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 세포	증권 시세	CRL-1658
OAI 접촉 교정기	오이	200	UV 포토리소그래피
옥타데카네티올(C18)	시그마	O1858-25ML
오비탈 쉐이커	폭스바겐	89032-088
인산염 완충 식염수(PBS)	국제 연구 제품	P32080-100티
폴리디메틸실록산 실가드 184	다우코닝	DC4019862
실리콘 웨이퍼	대학 웨이퍼	아이디#809
나트륨 피루브산	써모 피셔 사이언티픽	제11360-070
SU-8 3050 포토레지스트	마이크로켐	Y311075 0500L1GL
티타늄 증발 펠릿	국제 고급 재료	타이14
투명 마스크(기능 포함)	Outputicity.com	해당 사항 없음	마스크 인쇄 서비스
트립신-EDTA (0.25%)	써모 피셔 사이언티픽	제25200-072

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