Extracellular Vesicle Uptake Assay: 3D 형광 이미징 기법을 사용하여 세포외 소포의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 방법

Abstract

출처: Kim, C. J., et al., 컨포칼 현미경 이미징 분석을 통한 세포외 소포 흡수 분석. J. Vis. 특급. (2022).

이 비디오에서는 세포외 소포체 또는 EV의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 컨포칼 현미경을 사용하여 3D 형광 이미징을 활용하며 내재화된 EV와 세포 표면에 부착된 EV를 구별할 수 있습니다.

Protocol

1. EV 절연 및 온칩 면역 형광 EV 라벨링

1. 세포 배양 배지(CCM) 수집 및 EV 분리를 위한 CCM 전처리
   1. 75cm² 세포 배양 플라스크에서 30% 포화도로 PC3 세포를 파종합니다. 대조 세포가 표준 배지 및 세포주 특이적 보충제에서 90% 포화도(~48시간)까지 성장할 수 있습니다.
      메모: EV 함유 성분이 세포 흡수에 영향을 미치지 않도록 하려면(예: 소 태아 혈청) 엑소좀이 고갈된 배지와 보충제를 사용하십시오.
   2. CCM을 수확합니다.
   3. CCM을 실온(RT)에서 10분 동안 1000 x g으로 원심분리하여 배지로 채취한 부착되지 않은 세포와 큰 파편을 펠릿화합니다. 상등액을 새 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   4. 새 튜브에서 상층액을 10,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 배지에 남아 있는 더 작은 파편과 세포사멸체를 펠릿화합니다. 일부 더 큰 EV는 펠릿이 될 것입니다. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다.
   5. 0.45μm 친수성 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인 주사기 필터를 통해 상층액을 여과합니다.
      메모: EV 절연을 위해 CCM을 즉시 처리하지 않는 경우 절연이 수행될 때까지 전처리된 CCM을 -80°C에서 보관하십시오. 동결된 경우 동결-해동 주기를 1로 제한하십시오.
2. 나노 여과 기반 미세유체 장치를 사용한 CCM에서 EV 절연
   1. 얼어붙은 경우 30단계 전에 CCM과 와류를 1.2.2초 동안 완전히 해동합니다.
   2. 전처리된 CCM 1mL를 나노 여과 기반 미세유체 장치의 시료 챔버에 주입합니다(재료 표 참조).
      메모: 나노 여과 기반 미세유체 장치에 대한 표준 작동 절차를 따르십시오.
   3. 벤치탑 방적기(재료 표 참조)에서 3000rpm으로 10분 동안 회전하여 미세유체 장치를 작동합니다.
      메모: 초기 실행 후 CCM이 샘플 챔버에 남아 있는 경우 모든 CCM이 샘플 챔버에서 비워질 때까지 추가 스핀을 수행합니다.
   4. 피펫팅으로 폐기물 챔버에서 유체를 제거하고 1.2.1, 1.2.2 및 1.2.3 단계를 두 번 반복합니다.
      메모: 총 3mL의 CCM이 EV 격리를 위해 처리됩니다.
   5. 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 시료 챔버에 주입하여 분리된 EV를 세척합니다. 1.2.3 단계에서 언급 한 바와 같이 미세 유체 장치를 작동하기위한 벤치 탑 방적 기계에서 회전합니다. 장치의 멤브레인에서 순수 EV를 찾습니다.
      메모: 특히 나노여과 기반 미세유체 소자에서 분리된 EV의 품질은 이전 연구에서 투과전자현미경(TEM), 주사전자현미경(SEM), 나노입자 추적 분석(NTA), 구조화 조명 현미경, 효소 결합 면역흡착 분석 및 Real-Time PCR을 통해 기존 UC 방식과 비교하고
   확인할 수 있었다.
3. 나노 여과 기반 미세유체 장치를 사용한 EV의 면역형광 라벨링(그림 1)
   1. 분석의 목적에 따라 EV 특이적 항체를 선택합니다(재료 표 참조).
      메모: 특정 항체는 EV-흡수 경로에 특이적인 리간드 결합 부위(즉, 세포내이입)를 방해할 수 있습니다.
   2. 100μL의 분리된 EV가 들어 있는 장치의 용출 구멍에 1μg/mL의 EV 특이적 항체를 주입합니다.
   3. 샘플 전체에 항체가 고르게 분포되도록 하기 위해 플레이트 셰이커에서 RT로 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다.
   4. 용리 구멍에 접착 테이프를 부착합니다. 1mL PBS를 시료 챔버에 주입하여 잔류 항체를 씻어냅니다.
   5. 시료 챔버가 비워질 때까지 3000rpm으로 장치를 돌립니다. 피펫팅으로 폐기물 챔버에서 액체를 제거하십시오. 1mL PBS를 시료 챔버에 주입합니다.
      메모: 형광 표지된 EV는 멤브레인 챔버에 위치합니다.
   6. 형광으로 표지된 EV(그림 2)를 멤브레인 챔버에서 호박색 튜브로 피펫팅합니다. 사용할 때까지 빛을 차단하십시오.

2. EV-uptake assay를 위한 형광 표지된 EV로 세포 배양

1. 세포 배양 호환 접시에서 표적 세포 파종 및 배양.
   1. 1 x 10⁴ PC3 세포를 0.2mL 배지가 있는 마이크로슬라이드 8웰 플레이트(각 웰당 9.4 x 10.7mm)에 넣거나 4 x 10⁴ PC3 세포를 1mL 배지가 있는 35mm 접시에 시딩합니다. 얇은 커버슬립(두께: 0.18mm)으로 구성된 세포 배양 호환 접시에 세포를 플레이트합니다.
      메모: 얇은 커버슬립은 빛의 역산란을 최소화합니다.
   2. 세포가 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% CO₂ 농도, 90% 습도)에서 밤새 접착할 수 있도록 합니다.
   3. 엑소좀이 고갈된 배지로 부착된 세포를 두 번 세척합니다(1.1.1단계에서 설명).
2. 형광 표지된 EV를 사용한 세포 배양.
   1. 나노입자 추적 분석(NTA, 그림 3)을 통해 형광 표지된 EV의 농도를 측정합니다(1.3.5단계). 배양된 세포에 첨가할 형광 표지된 EV의 최적 농도를 결정합니다(단계 2.1.2.).
   2. 2.2.1단계에서 측정한 원하는 농도와 일치하도록 형광 표지된 EV를 엑소좀이 고갈된 배지로 희석합니다. (즉, 200μL의 엑소좀이 고갈된 배지에서 7.80 x 10⁹ EV(NTA 값))
   3. 2.1.2에서 제조된 부착 대상 세포에 희석된 EV를 첨가합니다(2.2.2단계). 실험 시간(즉, 4시간, 8시간 또는 12시간) 동안 배양합니다.
   4. 엑소좀이 없는 배지로 세포를 세 번 세척하여 내부화되지 않은 EV를 제거합니다.
      메모: 선택 사항: 세척 후 셀을 고정할 수 있습니다.
   5. 부착된 세포의 세포질을 1μg/mL의 CMTMR((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine)으로 라벨링하고(재료 표 참조) 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% CO₂ 농도, 90% 습도)에서 배양합니다.
      메모: 세포 면적 염료는 EV 흡수 분석 중에 스파이크된 EV의 공간적 위치(내부화 또는 표면적)를 결정하는 데 도움이 되도록 라벨링된 EV와 별도로 형광을 발해야 합니다.
   6. 라벨링된 세포를 엑소좀이 고갈된 배지로 두 번 세척하여 잔류 염료를 제거합니다. 라이브 셀 컨포칼 이미징을 준비하기 위해 세포에 새로운 엑소좀이 고갈된 배지를 추가합니다.

3. 컨포칼 현미경 검사

1. 라이브 셀 이미징을 수행하려면 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5%_CO2 농도, 90% 습도)을 유지하기 위해 온스테이지 인큐베이터를 활용하십시오.
2. 준비된 세포를 온스테이지 인큐베이터에 놓습니다.
3. 컨트롤 samples.
   를 기반으로 이미징 매개 변수를 설정합니다. 메모: 제안된 대조군 샘플에는 형광 표지된 EV만, 형광 표지된 세포, 표지되지 않은 EV 및 표지되지 않은 세포가 포함됩니다.
4. 3D 컨포칼 이미지를 획득하기 위해 대상 셀의 깊이와 z 방향의 적층 크기 범위를 결정합니다.
   메모: Z-스택의 두께는 1μm입니다. 컨포칼 3D 이미지 획득은 2분 34초 동안 지속되었습니다(각 Z-평면 이미지 획득에는 약 8초가 소요되었으며 총 20개의 Z-스택 이미지).
5. 세포 특이적 염료(즉, 빨간색)와 EV 특이적 염료(즉, 녹색)를 동시에 여러 개의 z-스택 이미지로 이미지 획득을 설정합니다(그림 4 및 그림 5A).

4. 이미지 처리

1. 자동 이미지 처리 소프트웨어를 활용하여 원시 z-스택 컨포칼 이미지를 분석하고 셀의 EV 흡수를 결정합니다(재료 표 참조).
2. 임계값 매개변수를 세포의 형광 신호와 EV 특이적 염료에 설정합니다. 셀의 가상 표면을 구축합니다(그림 5A,B).
   1. 셀의 가상 표면을 구축하려면 Add new Surfaces 버튼을 클릭하십시오.
   2. "알고리즘 설정"으로 최단 거리 계산을 선택하여 소프트웨어에서 제공하는 알고리즘을 사용하고 다음: 소스 채널을 클릭합니다.
   3. 이 실험에서 채널 2 - CMTMR을 "소스 채널"로 선택합니다.
   4. 스무딩을 선택하고 곡면 다듬기를 위해 "Surfaces Detail"에 적절한 값을 입력합니다.
      참고: 1픽셀은 원시 이미징 데이터에서 0.57μm를 나타내기 때문에 이 실험에서는 0.57μm입니다.
   5. Absolute Intensity(절대 강도)를 "Thresholding(임계값 설정)"으로 선택합니다.
   6. 제공된 알고리즘에 의해 형광 이미지의 임계값을 자동으로 설정하려면, 임계값(절대 강도): 값이 자동으로 설정됩니다.
   7. "Split touching Objects (Region Growing)"로 Enable을 선택하고 이 실험에서 예상 셀 크기 값을 "Seed Points Diameter"(10.0μm)에 넣습니다. 그런 다음 다음: 시드 포인트 필터링을 클릭합니다.
   8. 가상 셀 표면을 구성하려면 + Add 버튼을 클릭한 다음 Quality를 "Filter Type"으로 선택합니다. 육안 검사를 통해 하한에 대한 적절한 값(이 실험의 경우 210)과 상한에 대한 최대값(1485)을 임계값으로 설정한 다음 Finish 버튼을 클릭합니다.
      메모: 육안 검사는 연구자가 원시 형광 이미지와 세포 영역을 구별할 수 있음을 의미합니다.
   9. 다음으로, EV의 가상 점을 구축하려면 새 스팟 추가 버튼을 클릭합니다.
   10. "Algorithm Settings(알고리즘 설정)"에서 다양한 스폿 크기(Region Growing) 및 최단 거리 계산을 선택한 후 Next: Source Channel(다음: 소스 채널)을 클릭합니다.
   11. 이 실험에서 채널 1 - Alexa Fluor 488을 "소스 채널"로 선택합니다.
   12. 스폿 감지를 위해 "Estimated XY Diameter"에 적절한 값(이 실험에서는 1μm)을 입력합니다. 그런 다음 다음: 스팟 필터링을 클릭합니다.
   13. 가상 EV 도트를 구성하려면 + 추가 버튼을 클릭하고 품질을 "필터 유형"으로 선택한 다음 육안 검사로 "하한 임계값"을 설정합니다(이 실험에서는 100). 그런 다음 다음: 스팟 리전 유형(Next: Spot Region Type) 버튼을 클릭합니다.
   14. Absolute Intensity를 "Spot Regions Type"으로 선택하고 Next: Spot Regions를 클릭합니다.
   15. EV 점의 영역인 임계값에 대해 육안 검사를 통해 "Region Threshold"에 적절한 값을 입력하고 이 실험에서는 100을 "Region Threshold"로 입력합니다.
       메모: 육안 검사는 연구원이 원시 형광 이미지와 EV 영역을 구별할 수 있음을 의미합니다.
   16. Region Volume을 "Diameter from"으로 선택하고 Finish를 클릭합니다.
3. 소프트웨어에서 제공하는 알고리즘을 사용하여 4.2단계에서 구축된 표면 내부의 그룹화된 지점을 분할합니다(그림 5C, i-iv).
   1. 빌드된 스폿을 클릭한 다음 필터로 이동합니다.
   2. + 추가 버튼을 클릭한 다음 필터 유형으로 Shortest Distance to Surfaces = Surface 1을 선택한 다음 Duplicate Selection to new Spots(새 스폿에 선택 항목 복제) 버튼을 클릭합니다. 하한에 대한 가장 낮은 임계값(이 실험의 경우 -7.0)과 상한에 대한 적절한 값(-0.5)입니다.
      메모: 스폿의 예상 반경으로 상한을 설정합니다. 이 실험에서 스폿, 즉 EV 도트의 예상 직경은 4.2.11 단계에서 1μm로 설정되었습니다. 따라서 상한은 0.5가 될 수 있습니다.
4. 셀 내부의 EV 자동 계수
   메모: 소프트웨어는 셀 내부의 EV 수를 자동으로 계산하여 대상 셀에 의해 내재화된 수를 나타냅니다.
   1. 빌드된 스폿 1 선택 항목[표면까지의 최단 거리, 표면 = -7.00과 -0.500 사이의 표면 1]을 클릭합니다.
   2. 통계로 이동하여 "Total Number of Spots"에서 값을 내보냅니다
      메모: 소프트웨어에서 제공하는 알고리즘은 셀의 수와 부피를 자동으로 계산합니다.
5. 위에서 계산된 값을 기반으로 잠복기당 EV 흡수율을 결정합니다(그림 6).
   1. 셀 수를 얻으려면 Built Surfaces 1을 클릭한 다음 Statistics로 이동하여 Overall에서 "Total Number of Surfaces" 값을 내보냅니다.
   2. Detailed(세부 정보)에서 Volume(볼륨)을 Detailed(세부 정보)로 내보냅니다.

Results

그림 1: 나노 여과 기반 미세유체 장치를 사용한 EV 절연 및 온칩 라벨링의 개략도.(A) CCM에서 EV 절연. (B) EV의 온칩 면역형광 라벨링. (C) 결합되지 않은 항체의 제거.

그림 2: 형광 표지된 EV의 이미징.형광 표지(anti-CD63-Alexa Fluor 488) EV는 컨포칼 현미경(40x 대물렌즈)을 사용하여 검출되었...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 항체	바이오레전드	353038	형광 염료 접합 EV 특이적 항체
CellTracker 오렌지 CMTMR 염료	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	C2927	라이브 셀(세포질) 형광 라벨링 시약
CFI 아포 람다 S 40XC 위스콘신	니콘	MRD77400	컨포칼 이미징 대물렌즈, NA=1.25
CFI 플랜 Apo VC 20X	니콘	MRD70200	컨포칼 이미징 대물렌즈, NA=0.75
엑소디스크	랩스피너 Inc.	전 D1001	EV 절연을 위한 나노 여과 기반 미세유체 장치
엑소디스커버리	랩스피너 Inc.	EX-R1001	Exodisc용 조작장치
엑소좀 고갈 FBS	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A2720801	PC3 세포주 유래 EV 수집을 위한 세포 배양 배지의 영양소
소 태아 혈청(FBS)	폭스바겐	1500-500	세포 배양을 위한 영양소
염소 안티-마우스 IgG H&L 사전 흡착	아브캠	ab7063	EV 라벨링의 부정적 제어를 위한 마우스 IgG 항체
Ibidi USA U 디쉬 μ - 디쉬 35mm	이비디	81156	컨포칼 이미징을 위한 배양 접시
이마리아스 9.7.1	옥스포드 악기	9.7.1	사후 이미지 처리 소프트웨어
인큐베이터 시스템 + CO2 / O2 / N2 가스 혼합기	라이브 셀 기기	투-O-20	살아있는 세포 이미징을 위한 인큐베이터 시스템
니콘 A1 HD25 / A1R HD25 카메라	니콘	해당 없음	컨포칼 이미징을 위한 카메라
Nikon Eclipse Ti 현미경	니콘	해당 없음	컨포칼 이미징을 위한 도립 현미경
NIS-엘리먼트 AR 4.50.00	니콘	4.50.00	Nikon 현미경용 이미지 처리 소프트웨어
NTA, 나노사이트 NS500	맬번 파날리티칼	NS500	전기차 농도 측정 장치
오리진프로 2020	오리진랩	9.7.0.185	그래프 소프트웨어
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	세포 배양을 위한 항생제
RPMI 1640	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	21875034	PC3 세포주 배양을 위한 세포 배양 배지
SYTO RNASelect 녹색 형광 세포 염색 - DMSO의 5mM 용액	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	S32703 (영어	EV 라벨링을 위한 RNA 염색 형광 염료