Virus-like Particles Capture Assay: 중화 항체 접합 마그네틱 비드를 사용하여 샘플에서 항원 표시 VLP를 분리하는 방법

초록

출처: Rosengarten, J. F., et al. capture assay를 사용하여 바이러스 유사 입자(VLP) 기반 백신에 표시된 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출. J. vis. 특급 (2022).

이 비디오에서는 샘플에서 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)를 분리하기 위해 VLP 포획 분석이라고 하는 면역침전 분석을 시연합니다. 항원은 자기 비드에 결합된 특정 항체와 결합하여 고정화된 항원-항체 복합체를 형성하고 나중에 추가 분석을 위해 분리 및 저장됩니다.

프로토콜

1. 시료 준비

1. 293-F 발현 배지에서 HIV 구조 유전자 gag를 단독으로 또는 env와 함께 발현하는 293-F 세포에서 유래한 VLP 생산자 현탁 세포주를 시딩합니다.
2. 37 ° C 및 8 % CO₂에서 3-4 일 동안 5cm의 궤도와 분당 135 라운드 (rpm)의 쉐이커 인큐베이터 회전에서 팽창시킵니다.
3. 100 x g에서 5분 동안 원심분리를 통해 생산자 세포를 펠렛화하고, 0.45μm 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 잔류 세포와 세포 파편을 제거하기 위해 정제된 상등액을 여과하여 무세포 배양 상등액(CFSN)을 얻습니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. CFSN은 4°C에서 밤새 보관할 수 있습니다.
4. CFSN을 실험에 직접 사용하거나 초원심분리(112,700 x g, 4°C, 1.5시간)를 사용하여 35mL의 CFSN에서 VLP를 펠릿
화합니다.
5. 초원심분리 시 상등액을 버리고 원심분리기 튜브당 15%(w/v) 트레할로스 용액 200μL에 VLP 펠릿을 현탁합니다.
   알림: VLP 펠릿은 종종 육안으로 보이지 않습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. VLP는 –80°C에서 보관할 수 있습니다.
6. VLP 포획 분석 전에 ELISA를 사용하여 VLP 함유 샘플의 바이러스 코어 단백질 농도를 측정합니다. 이 단계는 캡처 분석 입력을 표준화하는 데 중요합니다.

2. VLP 캡처 분석

참고: 워크플로우에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 위아래로 피펫팅하거나 50rpm의 회전기에서 최소 5분 동안 혼합하여 마그네틱 비드를 매달아 놓습니다.
2. 한편, bNAbs를 함유하는 항체 용액을 준비합니다. 반응당 200μL의 항체 결합 및 세척 완충액(재료 표 참조)에 각 bNAb 10μg을 사용합니다.
   참고: 항체 양은 bNAb의 친화력과 사용된 VLP의 항원 데코레이션 밀도에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 반응당 50 μL의 마그네틱 비드 용액(재료 표 참조)을 사용하고 비드를 1.5 mL 반응 튜브로 옮깁니다. 튜브를 자기 분리 랙에 놓습니다.
   참고: 또는 각 튜브에 강력한 단일 자석을 사용하여 상층액에서 비드를 분리할 수 있습니다.
4. 모든 비드가 수집되었는지 확인하기 위해 비드가 튜브 벽에 모일 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 상층액을 제거합니다.
5. 자석을 제거하고 2.2단계에서 준비한 bNAb 용액 200μL에 비드를 현탁합니다. 실온에서 50rpm으로 회전체에서 혼합하여 30분에서 3시간 동안 배양합니다.
6. 반응 튜브를 자기 분리 랙에 다시 놓고 기다렸다가 상등액을 제거합니다.
7. 자석에서 튜브를 제거하고 200μL의 항체 결합 및 세척 완충액에 재현탁하여 비드를 세척합니다.
8. 2.4단계를 반복합니다. 세탁 버퍼를 최대한 제거하십시오.
9. 비드 결합 bNAbs.
   에 샘플을 추가합니다. 참고: HIV 유래 입자를 사용한 포획 분석을 위한 VLP 입력은 반응당 최소 15ng의 바이러스 코어 단백질이어야 합니다. VLP 양은 bNAb의 친화도 및 사용된 VLP의 항원 데코레이션 밀도에 따라 달라질 수 있습니다.
10. 2.9단계에서 추가한 샘플 부피가 1mL 미만인 경우 PBS를 추가하여 샘플 부피를 1mL로 조정합니다. 피펫팅으로 비드를 부드럽게 매달아 놓습니다.
11. 샘플과 비드를 실온의 회전기에서 2.5시간 동안 배양합니다. 비드가 현탁액에 남아 있고 용액이 배양 중에 완전히 혼합되었는지 확인하십시오.
12. 자석에 튜브를 놓고 상층액을 제거합니다.
13. 마그네틱 비드를 200μL의 세척 버퍼에 현탁하여 세척합니다(재료 표 참조). 세탁 단계를 세 번 반복합니다.
14. 100μL의 세척 버퍼에 비드를 현탁시키고 현탁액을 깨끗한(내열성) 반응 튜브로 옮깁니다.
15. 튜브를 자기 분리 랙(재료 표 참조)에 놓고 상층액을 완전히 제거합니다.
16. 2.16.1-2.16.2 단계에 따라 변성 SDS-PAGE 샘플 또는 2.16.3-2.16.5 단계에 따라 마그네틱 비드에서 VLP를 용출하여 비변성 샘플을 준비합니다.
    1. 변성 SDS-PAGE 샘플을 준비하려면 20-80 μL의 Laemmli 완충액(p55 Gag 분석 입력 1ng당 0.8 μL의 Laemmli 완충액)에 비드를 현탁하고 95 °C에서 5분 동안 배양합니다.
    2. SDS-PAGE로 직접 진행하거나 샘플을 -20°C.
       에서 보관하십시오. 주의: Laemmli 완충액에는 2-메르캅토에탄올과 도데실황산나트륨이 포함되어 있습니다. 보호 장갑과 보안경을 착용하십시오. 피부, 눈, 의복에 닿지 않도록 하십시오. 증기를 흡입하지 마십시오. 환기가 잘 되는 공간(예: 흄 후드)에서 작업하십시오.
       참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
    3. 또는 비변성 용리 단계를 수행하여 비변성 단백질 구조가 보존된 VLP를 얻을 수 있습니다.
    4. 마그네틱 비드에 25μL의 용리 완충액(비드와 함께 제공되는 경우가 많음)을 추가하고 실온에서 2-5분 동안 배양합니다.
    5. 비드를 제거하고 용출액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 후속 분석을 위해 용리액을 사용하거나 4°C에서 보관하십시오.
       참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

결과

그림 1: cell-free 상등액을 사용한 VLP 포획 분석의 주요 단계에 대한 개략도.(1) VLP 포획 분석은 HIV-1 bNAbs가 단백질 G 결합 마그네틱 비드에 결합하는 것으로 시작됩니다. 한편, p55 농도가 정의된 VLP 용액이 준비됩니다. 무세포 배양 상등액은 p55 Gag VLP, 숙주 세포 단백질 및 핵산의 혼합물로 구성됩니다. (2) bNAbs 및 VLP 용액에 결합된 마그네틱 비드를 1.5mL 반응 튜브로 옮긴 후 회전하면서 배양합니다. (3) 항원 표시 VLP는 bNAbs 코팅 비드에 의해 캡처됩니다. 숙주 세포 유래 오염 물질로부터 이러한 면역 복합체의 분리는 자기장에서 수행됩니다. (4<...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 반응 튜브	에펜도르프
PBS 10배	지브코	70011044
항체(bnAbs)	폴리문 사이언틱
Dynabeads 단백질 G 면역침전 키트	invitrogen(Thermo Fisher Scientific)	10007D	버퍼 및 세척 포함 솔루션
프리스타일 293-F 셀	invitrogen(Thermo Fisher Scientific)	제790호-07
프리스타일 293 익스프레션 미디엄	invitrogen(Thermo Fisher Scientific)	12338026
자기 분리 랙	뉴잉글랜드 바이오랩스	S1509에스	12 x 1.5 mL 또는 6 x 1.5 mL 튜브용
Optima XE-90 초원심분리기	벡크만 쿨터
폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 주사기 필터, 0.45μm	칼 로스	KC89.1
PVDF 전사막, 0.45 μm	칼 로스	T830.1
퀵타이터 HIV p24 엘리사	세포 바이오랩(Cell Biolabs)	VPK-108-H
회전자	하이돌프	렉스2
SW28 로터	벡크만 쿨터
써모믹서	셀 미디어	기초의
트레할로스 이수화물	칼 로스	8897.2
울트라 클리어 원심분리기 튜브	벡크만 쿨터	344058