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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 새로운 챔버 디자인(그림 1)
- 새로운 이중 챔버 셀 분석기 플레이트를 엽니다. 전극이 있는 상단 챔버를 따로 보관하십시오.
- 밀링 머신을 사용하여 세포 분석기 플레이트의 U자형 하단 웰 2mm를 깎아냅니다.
- UV 큐레이티드 접착제를 사용하여 0.2μm 공극 크기의 2cm x 7cm 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인을 면도한 웰의 바닥에 부착합니다. 접착제가 완전히 경화되고 불활성이 되도록 30분의 큐레이션 시간을 허용합니다.
- 밀링 머신을 사용하여 측면을 따라 두 개의 세로 슬릿(1.5mm x 5.6mm)을 잘라내어 새로 제작된 세 번째 챔버의 능선에 끼웁니다.
- 밀링 머신을 사용하여 세포 분석기 플레이트의 전체 치수(72mm x 18mm(재료 표))를 복제하는 세 번째 폴리카보네이트 챔버를 만듭니다.
- 깊이 4.8mm, 직경 4.75mm의 웰을 만들어 세포 분석기 플레이트의 16웰 설계를 재현합니다. 이를 통해 웰당 90μL의 부피를 사용할 수 있습니다.
- 측면에서 두 개의 삼각형 융기를 만들어 챔버가 1.4단계에서 만든 원래 슬릿에 잠기도록 합니다. 삼각형의 수평 부분은 1.5mm, 수직은 1.4mm, 빗변은 2.052mm입니다.
- 직경이 50.8mm이고 높이가 1.397mm인 짧은 면에 원래 플레이트의 노치에 맞도록 손잡이를 만듭니다(그림 1, 중간).
- 각 웰에 0.9mm 두께의 고무 와셔를 사용하여 밀봉된 핏을 제공합니다.
2. 세포 배양 (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-섬유아세포)
- 부착성 세포 배양액(~70% confluence)을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
- 0.05% 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 제거합니다.
- 혈청을 함유한 세포 배양 배지로 트립신 용액을 중화하고 세포 현탁액의 분취액을 사용하여 세포를 계수합니다.
메모: 특정 세포 배양 배지는 표 1에서 확인할 수 있습니다.
3. 환자 유래 이종 이식 해리
- 멸균 메스를 사용하여 새로운 종양 조각(1cm2)을 곱게 자릅니다.
- 3mg/mL 트립신과 2mg/mL 콜라겐분해효소가 보충된 20mL의 DMEM F12 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
- 37°C의 써멀 쉐이커(150 RPM)에서 20분 동안 배양합니다.
- 튜브를 500 x g에서 5분 동안 돌리고 상층액을 제거합니다.
- 세포를 세척하기 위하여 DMEM F12 20 μL + 2% FBS를 추가하십시오; 5 분 동안 300 x g에 회전시키고 상등액을 제거하십시오. 세탁을 두 번 더 반복합니다.
- 1mL의 PDX 배지(표 1)에 재현탁하여 세포 계수를 수행합니다.
4. 골수 세포 추출
- 골수(BM) 채취 필터를 25mL의 1x PBS.
로 플러시합니다.
메모: 본 연구에서는 병원에서 사용한 BM 채취 필터에 PBS를 첨가하여 필터에 남아 있는 BM을 수집하였다.
- 플러시된 BM을 25mL의 밀도 구배 매체가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 천천히 추가하고 층을 가능한 한 분리하도록 주의합니다.
- 800 x g에서 18°C에서 20분 동안 회전합니다.
- 원심분리(지방/혈장) 후 상층을 빨아들이고 BM 세포가 있는 밀도 구배 매체 위의 흰색 층 5mL를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
메모: 또는 5mL 피펫을 중간층(BM)에 닿을 때까지 상층부에 담그고 피펫을 움직이지 않고 중간층을 매우 천천히 피펫팅합니다.
- 15mL 코니컬 튜브에 1x PBS(~10mL)를 채우고 300 x g에서 15분 동안 회전합니다.
- 상등액을 제거하십시오. 남은 흰색 펠릿은 BM입니다.
- 펠릿에서 적혈구가 관찰되면 RBC 용해 용액(재료 표) 5mL를 넣고 실온(RT)에서 5분 동안 그대로 둡니다. 300 x g에서 5분 동안 회전하고 상층액을 제거합니다.
- 1x PBS 10mL를 첨가하여 세포를 세척하고 300 x g에서 5분 동안 회전한 후 상층액을 제거합니다. 펠릿이 흰색이 될 때까지 RBC 용해(4.7단계)를 반복합니다.
5. 세포 시딩 및 조립
- 3개의 멸균 챔버를 모두 조직 배양 후드에 놓습니다.
- 하단 챔버의 짧은 쪽에서 손잡이를 찾습니다. 손잡이가 실험자를 향하도록 하단 챔버의 방향을 지정합니다.
- 90 μL의 배지에 있는 30,000-50,000개의 세포를 하부 챔버의 각 웰에 추가합니다. 기포가 생기지 않도록 하십시오. 이들은 분비 인자를 제공하지만 상부 챔버의 전극에 의해 감지되지 않는 기질 세포입니다.
- 세포 운동성에 대한 양성 대조군으로 두 개의 하부 챔버 웰에서 5% 소 태아 혈청 보충 배지를 사용합니다. 0% 혈청 보충 배지를 음성 대조군으로 사용하십시오.
- 세포가 있는 하부 챔버를 후드에 10-15분 동안 두어 가라앉힙니다.
메모: 이 단계는 세포가 부착되어 있거나 현탁액으로 성장하는 경우에 권장됩니다.
- 하단 챔버를 90° 회전하고 하단 챔버의 손잡이가 중간 챔버의 노치로 밀어 넣도록 중간 챔버를 위에 놓습니다.
메모: 하단 챔버의 손잡이와 중간 챔버의 파란색 점은 어셈블리의 반대쪽 끝에 있습니다.
- 어셈블리의 각 긴 면에서 딸깍 소리가 들릴 때까지 수직으로 아래로 밉니다.
- 160μL의 무혈청 배지를 중간 챔버의 모든 웰에 추가합니다.
- 웰을 채운 후 돔 모양의 메니스커스가 보이는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 파이펫 보정에 따라 최종 부피를 조정하십시오. 기포가 생기지 않도록 하십시오.
- 전극이 아래를 향하도록 상단 챔버를 중간 챔버에 놓고 중간 챔버와 상단 챔버에 파란색 점을 정렬해야 합니다.
- 어셈블리의 각 긴 면에서 딸깍 소리가 들릴 때까지 수직으로 아래로 밉니다.
- 25-50 μL의 무혈청 배지를 상단 챔버에 추가합니다.
- 조직 배양 인큐베이터의 이중 목적 세포 분석기에 어셈블리를 장착하고 배경을 측정하기 전에 30분 동안 기다립니다.
메모: 이 시간은 어레이를 평형화하는 데 필요하며 상부 챔버에 추가할 세포주를 준비하는 데 사용할 수 있습니다.
- 배경을 측정하고(섹션 6 참조) 어셈블리를 조직 배양 후드에 다시 놓습니다.
- 100μL의 무혈청 배지에 있는 30,000-50,000개의 세포를 상단 챔버의 각 웰에 추가합니다. 이들은 전극이 멤브레인을 통해 성공적으로 이동했을 때 감지하는 세포입니다
메모: 최대 반응을 얻으려면 분석을 수행하기 전에 6-18시간 동안 무혈청 또는 저혈청 배지에서 세포를 성장시키는 것이 좋습니다.
- 임피던스 측정을 위해 이중 목적 셀 분석기에 장착하기 전에 어셈블리를 후드에 30분 동안 그대로 두십시오.
6. 배경 및 임피던스 측정
- 어레이를 이중 목적 세포 분석기 기기의 크래들에 놓습니다.
- 세포 분석기 소프트웨어를 열고 사용할 크래들을 선택합니다.
- Message(메시지) 탭을 클릭하고 Connections OK(연결 확인)라고 표시되어 어레이가 크래들에 잘 배치되어 있고 전극이 센서와 잘 정렬되어 있는지 확인합니다.
- 실험 노트 탭을 클릭하고 실험에 대한 정보를 최대한 많이 입력합니다.
- Layout 탭을 클릭하고 배열 레이아웃에 대한 설명을 입력합니다.
- 스케줄 탭을 클릭하고 단계 메뉴에서 두 단계를 추가합니다. 백그라운드 단계(1회 스윕) 및 100회 스윕이 있는 테스트 단계(15분마다 스윕, 총 25시간)를 추가합니다.
- 어레이를 이중 목적 세포 분석기 인큐베이터에 30분 동안 넣은 후 재생 버튼을 클릭하여 백그라운드 측정을 시작합니다. 데이터를 저장할 폴더를 선택하라는 창이 나타납니다.
- 백그라운드 측정이 완료된 후 크래들에서 어레이를 제거하고 세포 배양 후드에 다시 놓습니다.
- 5.13단계에서 설명한 대로 상부 챔버에 세포를 추가하고 세포가 침전될 때까지 조직 배양 후드에 어셈블리를 30분 동안 유지합니다.
- 어레이를 이중 용도 셀 분석기에 다시 놓고 메시지 탭에서 Connections OK(연결 확인) 메시지를 확인합니다.
- 재생 버튼을 클릭하여 임피던스 측정을 시작합니다.
- 플롯 탭을 클릭하여 신호의 진행 상황을 모니터링합니다.
- 25시간 이전에 엔드포인트에 도달하면 Execute(실행) 드롭다운 메뉴에서 Abort(중단) 단계를 클릭합니다.
- 데이터를 내보내려면 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 목록 형식에서 복사를 선택한 다음 스프레드시트에 데이터를 붙여넣습니다.
메모: 데이터는 셀 인덱스 또는 델타 셀 인덱스로 내보낼 수 있습니다. 그래프 및/또는 레이아웃 정보도 선택하여 내보낼 수 있습니다.
표 1: 세포 배양 배지 조성. 이 표에는 MDA-MD-231 배지, J2 섬유아세포 배지, DCIS 배지 및 PDX 배지의 조성이 나열되어 있습니다.
| 미디어 | 성분 | 농도/비율 |
| MDA-MD-231 미디어 | DMEM을 참조하십시오. | |
| 소 태아 세럼(FBS) | 10% |
| J2 섬유아세포 매체 | DMEM을 참조하십시오. | |
| 소 태아 세럼(FBS) | 10% |
| DCIS 미디어 | DMEM F12 | |
| 호스 세럼 (HS) | 5% |
| 표피 성장 인자(EGF) | 20 ng/mL |
| 인슐린 | 10 μg/mL |
| 하이드로코르티손 | 0.5 μg/mL |
| 콜레라 독소 | 100 ng / mL |
| PDX 매체 | DMEM F12 | |
| 소 태아 세럼(FBS) | 2% |
| 헤페스 | 1 미터 |
| 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 에탄올아민(ITS) | 10 μg/mL |
| 하이드로코르티손 | 0.5 μg/mL |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 1 밀리그램 / mL |
