Three-chambered Array-based Impedance Assay: 전기 임피던스를 측정하여 암세포의 침습 가능성을 평가하는 실시간 분석 기법

초록

출처: Sharif, G. M. et al., 공동 배양에서 침입성 세포 하위 집단의 실시간 검출 및 캡처. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 전기 임피던스를 기반으로 하는 3챔버 어레이를 사용하는 침입 분석에 대해 설명합니다. 이 기술은 종양 미세환경에서 상주하는 기질 세포가 분비하는 수용성 인자의 영향으로 암세포의 침습 가능성을 측정합니다.

프로토콜

1. 새로운 챔버 디자인(그림 1)

1. 새로운 이중 챔버 셀 분석기 플레이트를 엽니다. 전극이 있는 상단 챔버를 따로 보관하십시오.
2. 밀링 머신을 사용하여 세포 분석기 플레이트의 U자형 하단 웰 2mm를 깎아냅니다.
3. UV 큐레이티드 접착제를 사용하여 0.2μm 공극 크기의 2cm x 7cm 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인을 면도한 웰의 바닥에 부착합니다. 접착제가 완전히 경화되고 불활성이 되도록 30분의 큐레이션 시간을 허용합니다.
4. 밀링 머신을 사용하여 측면을 따라 두 개의 세로 슬릿(1.5mm x 5.6mm)을 잘라내어 새로 제작된 세 번째 챔버의 능선에 끼웁니다.
5. 밀링 머신을 사용하여 세포 분석기 플레이트의 전체 치수(72mm x 18mm(재료 표))를 복제하는 세 번째 폴리카보네이트 챔버를 만듭니다.
6. 깊이 4.8mm, 직경 4.75mm의 웰을 만들어 세포 분석기 플레이트의 16웰 설계를 재현합니다. 이를 통해 웰당 90μL의 부피를 사용할 수 있습니다.
7. 측면에서 두 개의 삼각형 융기를 만들어 챔버가 1.4단계에서 만든 원래 슬릿에 잠기도록 합니다. 삼각형의 수평 부분은 1.5mm, 수직은 1.4mm, 빗변은 2.052mm입니다.
8. 직경이 50.8mm이고 높이가 1.397mm인 짧은 면에 원래 플레이트의 노치에 맞도록 손잡이를 만듭니다(그림 1, 중간).
9. 각 웰에 0.9mm 두께의 고무 와셔를 사용하여 밀봉된 핏을 제공합니다.

2. 세포 배양 (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-섬유아세포)

1. 부착성 세포 배양액(~70% confluence)을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
2. 0.05% 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 제거합니다.
3. 혈청을 함유한 세포 배양 배지로 트립신 용액을 중화하고 세포 현탁액의 분취액을 사용하여 세포를 계수합니다.
   메모: 특정 세포 배양 배지는 표 1에서 확인할 수 있습니다.

3. 환자 유래 이종 이식 해리

1. 멸균 메스를 사용하여 새로운 종양 조각(1cm²)을 곱게 자릅니다.
2. 3mg/mL 트립신과 2mg/mL 콜라겐분해효소가 보충된 20mL의 DMEM F12 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
3. 37°C의 써멀 쉐이커(150 RPM)에서 20분 동안 배양합니다.
4. 튜브를 500 x g에서 5분 동안 돌리고 상층액을 제거합니다.
5. 세포를 세척하기 위하여 DMEM F12 20 μL + 2% FBS를 추가하십시오; 5 분 동안 300 x g에 회전시키고 상등액을 제거하십시오. 세탁을 두 번 더 반복합니다.
6. 1mL의 PDX 배지(표 1)에 재현탁하여 세포 계수를 수행합니다.

4. 골수 세포 추출

1. 골수(BM) 채취 필터를 25mL의 1x PBS.
   로 플러시합니다. 메모: 본 연구에서는 병원에서 사용한 BM 채취 필터에 PBS를 첨가하여 필터에 남아 있는 BM을 수집하였다.
2. 플러시된 BM을 25mL의 밀도 구배 매체가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 천천히 추가하고 층을 가능한 한 분리하도록 주의합니다.
3. 800 x g에서 18°C에서 20분 동안 회전합니다.
4. 원심분리(지방/혈장) 후 상층을 빨아들이고 BM 세포가 있는 밀도 구배 매체 위의 흰색 층 5mL를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
   메모: 또는 5mL 피펫을 중간층(BM)에 닿을 때까지 상층부에 담그고 피펫을 움직이지 않고 중간층을 매우 천천히 피펫팅합니다.
5. 15mL 코니컬 튜브에 1x PBS(~10mL)를 채우고 300 x g에서 15분 동안 회전합니다.
6. 상등액을 제거하십시오. 남은 흰색 펠릿은 BM입니다.
7. 펠릿에서 적혈구가 관찰되면 RBC 용해 용액(재료 표) 5mL를 넣고 실온(RT)에서 5분 동안 그대로 둡니다. 300 x g에서 5분 동안 회전하고 상층액을 제거합니다.
8. 1x PBS 10mL를 첨가하여 세포를 세척하고 300 x g에서 5분 동안 회전한 후 상층액을 제거합니다. 펠릿이 흰색이 될 때까지 RBC 용해(4.7단계)를 반복합니다.

5. 세포 시딩 및 조립

1. 3개의 멸균 챔버를 모두 조직 배양 후드에 놓습니다.
2. 하단 챔버의 짧은 쪽에서 손잡이를 찾습니다. 손잡이가 실험자를 향하도록 하단 챔버의 방향을 지정합니다.
3. 90 μL의 배지에 있는 30,000-50,000개의 세포를 하부 챔버의 각 웰에 추가합니다. 기포가 생기지 않도록 하십시오. 이들은 분비 인자를 제공하지만 상부 챔버의 전극에 의해 감지되지 않는 기질 세포입니다.
4. 세포 운동성에 대한 양성 대조군으로 두 개의 하부 챔버 웰에서 5% 소 태아 혈청 보충 배지를 사용합니다. 0% 혈청 보충 배지를 음성 대조군으로 사용하십시오.
5. 세포가 있는 하부 챔버를 후드에 10-15분 동안 두어 가라앉힙니다.
   메모: 이 단계는 세포가 부착되어 있거나 현탁액으로 성장하는 경우에 권장됩니다.
6. 하단 챔버를 90° 회전하고 하단 챔버의 손잡이가 중간 챔버의 노치로 밀어 넣도록 중간 챔버를 위에 놓습니다.
   메모: 하단 챔버의 손잡이와 중간 챔버의 파란색 점은 어셈블리의 반대쪽 끝에 있습니다.
7. 어셈블리의 각 긴 면에서 딸깍 소리가 들릴 때까지 수직으로 아래로 밉니다.
8. 160μL의 무혈청 배지를 중간 챔버의 모든 웰에 추가합니다.
9. 웰을 채운 후 돔 모양의 메니스커스가 보이는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 파이펫 보정에 따라 최종 부피를 조정하십시오. 기포가 생기지 않도록 하십시오.
10. 전극이 아래를 향하도록 상단 챔버를 중간 챔버에 놓고 중간 챔버와 상단 챔버에 파란색 점을 정렬해야 합니다.
11. 어셈블리의 각 긴 면에서 딸깍 소리가 들릴 때까지 수직으로 아래로 밉니다.
12. 25-50 μL의 무혈청 배지를 상단 챔버에 추가합니다.
13. 조직 배양 인큐베이터의 이중 목적 세포 분석기에 어셈블리를 장착하고 배경을 측정하기 전에 30분 동안 기다립니다.
    메모: 이 시간은 어레이를 평형화하는 데 필요하며 상부 챔버에 추가할 세포주를 준비하는 데 사용할 수 있습니다.
14. 배경을 측정하고(섹션 6 참조) 어셈블리를 조직 배양 후드에 다시 놓습니다.
15. 100μL의 무혈청 배지에 있는 30,000-50,000개의 세포를 상단 챔버의 각 웰에 추가합니다. 이들은 전극이 멤브레인을 통해 성공적으로 이동했을 때 감지하는 세포입니다
    메모: 최대 반응을 얻으려면 분석을 수행하기 전에 6-18시간 동안 무혈청 또는 저혈청 배지에서 세포를 성장시키는 것이 좋습니다.
16. 임피던스 측정을 위해 이중 목적 셀 분석기에 장착하기 전에 어셈블리를 후드에 30분 동안 그대로 두십시오.

6. 배경 및 임피던스 측정

1. 어레이를 이중 목적 세포 분석기 기기의 크래들에 놓습니다.
2. 세포 분석기 소프트웨어를 열고 사용할 크래들을 선택합니다.
3. Message(메시지) 탭을 클릭하고 Connections OK(연결 확인)라고 표시되어 어레이가 크래들에 잘 배치되어 있고 전극이 센서와 잘 정렬되어 있는지 확인합니다.
4. 실험 노트 탭을 클릭하고 실험에 대한 정보를 최대한 많이 입력합니다.
5. Layout 탭을 클릭하고 배열 레이아웃에 대한 설명을 입력합니다.
6. 스케줄 탭을 클릭하고 단계 메뉴에서 두 단계를 추가합니다. 백그라운드 단계(1회 스윕) 및 100회 스윕이 있는 테스트 단계(15분마다 스윕, 총 25시간)를 추가합니다.
7. 어레이를 이중 목적 세포 분석기 인큐베이터에 30분 동안 넣은 후 재생 버튼을 클릭하여 백그라운드 측정을 시작합니다. 데이터를 저장할 폴더를 선택하라는 창이 나타납니다.
8. 백그라운드 측정이 완료된 후 크래들에서 어레이를 제거하고 세포 배양 후드에 다시 놓습니다.
9. 5.13단계에서 설명한 대로 상부 챔버에 세포를 추가하고 세포가 침전될 때까지 조직 배양 후드에 어셈블리를 30분 동안 유지합니다.
10. 어레이를 이중 용도 셀 분석기에 다시 놓고 메시지 탭에서 Connections OK(연결 확인) 메시지를 확인합니다.
11. 재생 버튼을 클릭하여 임피던스 측정을 시작합니다.
12. 플롯 탭을 클릭하여 신호의 진행 상황을 모니터링합니다.
13. 25시간 이전에 엔드포인트에 도달하면 Execute(실행) 드롭다운 메뉴에서 Abort(중단) 단계를 클릭합니다.
14. 데이터를 내보내려면 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 목록 형식에서 복사를 선택한 다음 스프레드시트에 데이터를 붙여넣습니다.
    메모: 데이터는 셀 인덱스 또는 델타 셀 인덱스로 내보낼 수 있습니다. 그래프 및/또는 레이아웃 정보도 선택하여 내보낼 수 있습니다.

표 1: 세포 배양 배지 조성. 이 표에는 MDA-MD-231 배지, J2 섬유아세포 배지, DCIS 배지 및 PDX 배지의 조성이 나열되어 있습니다.

미디어	성분	농도/비율
MDA-MD-231 미디어	DMEM을 참조하십시오.
	소 태아 세럼(FBS)	10%
J2 섬유아세포 매체	DMEM을 참조하십시오.
	소 태아 세럼(FBS)	10%
DCIS 미디어	DMEM F12
	호스 세럼 (HS)	5%
	표피 성장 인자(EGF)	20 ng/mL
	인슐린	10 μg/mL
	하이드로코르티손	0.5 μg/mL
	콜레라 독소	100 ng / mL
PDX 매체	DMEM F12
	소 태아 세럼(FBS)	2%
	헤페스	1 미터
	인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 에탄올아민(ITS)	10 μg/mL
	하이드로코르티손	0.5 μg/mL
	소 혈청 알부민(BSA)	1 밀리그램 / mL

결과

그림 1: 어레이 챔버 및 수정 사항의 이미지.

(A) 어레이를 만드는 데 사용되는 세 개의 챔버. 전극을 품고 있는 상부 챔버에 대한 수정은 이루어지지 않았습니다. (B) 중간 챔버 우물에서 2mm 높이를 깎아내고 열린 바닥에 멤브레인을 부착했습니다. 세로 슬릿(1.5mm x 5.6mm)이 각 측면에 추가되었습니다. (C) 16-웰 설계를 복제하기 위해 제작된 하부 챔버(72mm x 18mm); 웰은 깊이가 4.8mm이고 직경이 4.75mm이며 삼각형 능선(가로 1.5mm x 세로 1.4mm)이 측면을 따라 추가되어 중간 챔버 슬릿에 딸깍 소리가 납니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신-EDTA	써모피셔	제25300-054
접착제	Norland 광학 접착제	노아63
소 혈청 알부민(BSA)	시그마	A9418
세포 리프터	사르슈테트	83.1832
비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에서 유래한 콜레라 독소	써모피셔	제12585-014
CIM 플레이트	애질런트 5665817001		세포 분석기 플레이트
Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해 효소	시그마	C0130
DMEM을 참조하십시오.	써모피셔	11995-065
DMEM-F12	써모피셔	11875-093
소 태아 혈청(FBS), 열 비활성화	오메가 사이언티픽	FB-12 (영어
헤페스	써모피셔	15630106
호스 세럼 (HS)	지브코	16050-122
인간 EGF	페프로텍	AF-100-15
하이드로코르티손	시그마	H4001
인슐린 트랜스페린 셀레늄 에탄올아민(ITSX) (100개)	써모피셔	51500056
인슐린, 인간 재조합, 아연 용액	시그마	C8052
J2 섬유아세포	스템셀(RRID:CVCL_W667)	제100-0353
림프프렙	줄기세포	7851	mononuclear cells의 분리를 위한 Density gradient medium(밀도 구배 배지)
마트리겔	코 닝	제354230	기저막 매트릭스
MCFDCIS.com 세포(DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 셀	RRID:CVCL_0062
밀링 머신			브리지포트 시리즈 1 버티컬
인산염 완충 식염수(1x)	써모피셔	10010049
폴리에테르설폰(PES) 멤브레인	(주)스털리텍	PCTF029030
RBC 용해 용액	줄기세포	7800
RTCA DP 분석기	애질런트	3X16	이중 목적 세포 분석기
트립신	시그마	T4799

호 년 호 년 년 ) 년 호 년 호 년