출처: Wei, P., et al., 초파리 melanogaster에서 구연산염 합성효소 활성의 비색 분석. J. Vis. 특급 (2020)
이 비디오는 초파리의 조직 균질화에 존재하는 미토콘드리아 구연산염 합성 효소 활성 분석을 측정하기 위한 비색 분석을 설명합니다.
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방법 논문
구연산염 Synthase 활동 분석실험: 초파리 조직 균질산염에 있는 Mitochondrial 구연산염 Synthase 활동을 측정하는 비색 분석실험
1.4K 조회수
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2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. D. melanogaster를 위한 비색 구연산염 Synthase 활동 분석실험
- 각 샘플에 대해 10마리의 성충 파리를 수집합니다. 각 유전자형에 대해 최소 3회 이상의 샘플을 수집합니다.
- 각 샘플에 대해 1.5mL 시험관에 20mM HEPES(pH = 7.2), 1mM EDTA 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유한 500μL의 얼음-저온 추출 버퍼를 준비합니다.
- 마취 패드에서 CO2로 성인 파리를 마취하고 원하는 조직을 분리합니다. 예를 들어, 성체 파리 흉부를 분리하려면 한 쌍의 집게로 파리 흉부를 고정한 다음 가위를 사용하여 흉부와 복부의 경계를 따라 절단하여 파리 복부를 격리합니다. 근육 구연산염 합성 효소 활성 분석을 위해 파리 흉부를 수집합니다.
메모: 구연산염 합성효소 활성을 정상화하기 위해 사용하는 경우 이 단계에서 조직의 새로운 무게를 측정합니다. - 10마리의 성체 파리 흉부를 100μL의 얼음-저온 추출 완충액으로 즉시 옮기고 얼음 위의 절굿공이로 균질화합니다. 샘플을 얼음처럼 차갑게 유지하려면 얼음에서 5-10초 동안 샘플을 균질화한 다음 샘플을 얼음에 5초 동안 앉혀 두고 튜브의 모든 조직이 완전히 균질화될 때까지 반복합니다.
메모: 튜브를 테이프로 붙이고 균질액을 확인하여 균질액에 혈전이 없는지, 튜브의 조직이 완전히 균질화되었는지 확인합니다. 모든 샘플 처리는 얼음 위에서 수행해야 합니다. - 단백질 함량 측정을 위해 균질화된 각 시료 10μL를 새 튜브에 넣습니다. 단백질 측정을 위해 샘플을 ice.
에 보관하십시오. 메모: 단백질 샘플은 추후 분석을 위해 -80°C에서 냉동 및 보관할 수 있습니다. 단백질 농도는 구연산염 합성효소 활성의 정상화를 위한 내부 파라미터 역할을 합니다. - 나머지 각 샘플에 400μL의 얼음-저온 추출 버퍼를 추가하여 총 부피 500μL를 만듭니다. 기포 형성을 방지하기 위해 최소 5회 이상 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 각 반응에 대해 1 μL의 희석 된 세포 용해물을 새로 준비된 반응 용액 150 μL에 첨가합니다 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM 아세틸 CoA, 1 mM 옥살로 아세트산). 부드럽게 피펫팅하여 즉시 철저히 혼합하여 기포 형성을 피하십시오. 25°C에서 4분 동안 10-30초마다 412nm에서 흡광도를 측정하고 최소 10초 간격으로 412nm에서 흡광도를 측정합니다.
메모: 다른 시약을 피펫팅하기 전에 팁을 교체하고 웰에 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 시약의 불완전한 혼합은 측정에 변화를 일으킬 수 있습니다. 구연산염 합성효소 활성 분석은 온전한 미토콘드리아 질량을 정량화하는 데 사용되므로 샘플을 채취한 직후 실온에서 수행해야 합니다. 반응 완충액은 사용 직전에 준비해야 하며 보관해서는 안 됩니다. - 데이터를 광학 밀도(OD), 흡광도(abs)(Y축) 대 시간(분)(X축)으로 플롯합니다. 그런 다음 반응 속도가
인 곡선의 선형 부분에 대한 기울기를 계산합니다.
값을 샘플 단백질 농도로 나누어 구연산염 합성효소 활성을 정규화합니다. 시트르산 합성효소 활성은
로 계산됩니다.
메모: 샘플 단백질 농도는 단백질 농도 분석 키트로 측정할 수 있습니다.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산(HEPES) | 시그마-알드리치 | V900477 | |
| 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(트리즈마 베이스) | 시그마-알드리치 | V900483 | |
| 아세틸-CoA | 시그마-알드리치 | A2181 | |
| 디티오-비스-니트로벤조산(DTNB) | 시그마-알드리치 | D8130 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 시그마-알드리치 | V900106 | |
| 옥살로아세테이트 | 시그마-알드리치 | O4126 | |
| 펠렛 유봉 | 산곤 | F619072 | |
| 펠렛 유봉 모터 | 톈겐 | OSE-Y10 | |
| 플레이트 리더 | (주)바이오텍 | 누대 | |
| 단백질 BCA 분석 키트 | 베이오타임 | P0010S | |
| 가위 | WPI (영어) | 14124 | |
| 트리톤 X-100 | 산곤 | A110694-0100 |
