리소스타핀 기반 효소 보호 분석법: 세포외 박테리아의 효소 매개 선택적 사멸에 의한 세포 내 황색포도상구균 부하를 정량화하는 시험관 내 방법

초록

출처: Rigaill, J. et al. 항균 화합물의 황색포도상구균 내재화 및 세포 내 효능을 연구하기 위한 개선된 효소 보호 분석. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 A549 세포의 황색포도상구균 내재화를 정량화하기 위한 리소스타핀 기반 체외 효소 보호 분석을 시연합니다. 이 분석은 숙주 세포의 세포 내 박테리아 부하에 대한 정성적, 정량적 및 특성화 연구에 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 세포 접종

1. 항생제를 사용하지 않고 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 페놀 레드가 함유된 Dulbecco의 변형된 DMEM(Modified Eagle medium) 고포도당에서 A549 인간 상피 세포를 배양하는 것으로 시작합니다.
2. 저배율 현미경으로 24웰 플레이트의 모든 웰을 관찰하여 인간 상피 세포가 건강하고 예상대로 성장하고 있는지 확인합니다.
3. 사용한 세포 배양 배지를 24웰 플레이트에서 제거하고 폐기합니다.
4. 페놀 레드 없이 DMEM에서 제조된 황색포도상구균의 박테리아 현탁액 500μL를 추가하여 100% 융합 세포가 있는 각 웰에 접종합니다.
5. 36 ± 1 ° C 및 5 % CO₂.
   에서 2 시간 동안 세포를 배양합니다. 참고: 테스트할 각 조건(3회)에 대해 플레이트의 3개의 웰을 사용하고 최소 3개의 독립적인 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 배양 지연은 실험 목적에 따라 조정할 수 있습니다.

2. 개선된 효소 보호 분석법(iEPA)을 통한 세포 내 박테리아의 정량화

1. 멸균수에 2% Triton X-100 3.5mL와 트립신-EDTA 3.5mL가 포함된 4x 용해 완충액 7mL를 준비합니다.
2. 아세테이트 완충액에 10mg/mL의 리소스스타핀 원액을 준비하고 25μL를 극저온으로 분취합니다. -80 °C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
3. 250 μL의 리소스타핀 원액(10 mg/mL)과 225 μL의 0.1 M Tris-HCl을 혼합하여 1 mg/mL에서 새로운 리소스타핀 작업 용액 225 μL를 준비합니다. 4°C에서 최대 48시간 동안 보관하십시오.
4. 250μL의 리소스타핀 작업 용액에 6mL의 완전 감염 배지를 추가하여 리소스타핀이 보충된 6.25mL의 완전 감염 배지를 준비합니다.
5. 리소스타핀이 보충된 완전 감염 배지 250μL를 각 웰에 추가하고 플레이트를 손으로 돌려 플레이트를 부드럽게 교반합니다.
6. 36 ± 1 ° C에서 5 % CO₂에서 1 시간 동안 세포를 배양하여 리소 스타핀이 세포 외 박테리아를 죽이도록합니다.
7. 배양 시간이 끝나면 20mg/mL의 단백질 분해 효소 K 10μL를 각 웰에 첨가하여 리소스타핀을 비활성화합니다.
8. 실온에서 2분 동안 세포를 배양합니다.
9. 250μL의 4x 용해 완충액을 추가하여 삼투압 충격에 의해 세포를 용해합니다.
10. 36 ± 1 °C에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
11. 세포가 완전히 용해되고 균질화되었는지 확인하기 위해 웰 바닥 전체에 10회 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.
12. 자동 나선형 플래터를 사용하여 각 웰의 S. aureus 하중을 측정합니다.
13. 한천 플레이트를 36 ± 1 ° C에서 18-24 시간 동안 배양합니다.
14. 다음 날, 콜로니 카운터가 있는 콜로니의 수를 세어 각 웰의 세포 내 S. aureus 부하를 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 플레이트	코닝-팔콘	353047
A549 세포주	증권 시세	CCL-185
아세테이트 완충 용액 pH 4.6	플루카	31048	20mM 아세트산 나트륨에서 10mg/mL의 리소스트파힌 원액을 제조하는 데 사용됩니다.
AMBICIN(재조합 리소스타핀)	앰비	LSPN-50	동결건조된 재결합 리소스타핀. 장기 보관을 위해 -80 °C에서 동결하십시오.
COS - 콜롬비아 한천 + 5% 양 피	바이오메리외	43049	포도상구균 성장에 적합한 모든 한천 플레이트를 대신 사용할 수 있습니다.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 페놀 레드가 함유된 고포도	시그마-알드리치	D6429
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 페놀 레드가 없는 고포도	시그마-알드리치	D1145
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	시그마-알드리치	D8537
Dulbecco의 MgCl2 및 CaCl2를 함유한 인산염 완충 식염수, 멸균 여과	시그마-알드리치	D8662
Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 멸균 여과	시그마-알드리치	D8537
Easyspiral 희석	인터사이언스	414000	자동 희석기 및 나선형 플래터
소 태아 세럼	지브코	10270-106
단백질분해효소 K, 재조합 20 mg/mL	유로바이오	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, 로트 901727
스캔 4000	인터사이언스	438000	자동 콜로니 카운터
멸균수	오텍	600500
TC20 자동 세포 계수기	비오라드	1450102	자동 셀 카운터
트리스 1M pH 8.0	인비트로젠	AM9855G	0.1 M Tris-HCl에서 1 mg / mL의 lysostaphine 작업 용액을 준비하는 데 사용됩니다.
트리톤 X-100	시그마-알드리치	T8787
트립신 - EDTA 용액	시그마-알드리치	T3924	페놀 레드를 함유한 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액의 0.05% 돼지 트립신 및 0.02% EDTA
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