Bathophenanthroline Sulfonate-based colorimetric assay: 마우스 간 조직에서 비헴철의 정량화를 위한 간단하고 빠른 방법

초록

출처: Duarte, T. L., Neves, J. V. Bathophenanthroline 기반 비색 분석을 사용한 조직 비헴철 함량 측정. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오에서는 마우스 간 조직에서 비헴철 함량을 측정하는 비색 측정 기반 방법을 설명합니다. Bathophenanthroline sulfonate는 환원제의 존재 하에서 발색 기질로 사용되며, 이는 철을 chelatable 철 철로 변환합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 솔루션 준비

참고: 모든 시약과 용액을 철분이 없는 유리 제품 또는 일회용 플라스틱 제품으로 취급하고 준비하십시오. 철 오염의 위험이 있으므로 금속 실험실 재료(예: 스테인리스 스틸 주걱)가 시약이나 용액과 접촉하지 않도록 하십시오. 재사용 가능한 유리 제품에 철분이 없는지 확인하십시오. 적절한 실험실 세제로 재료를 30-60 분 동안 씻고 탈 이온수로 헹구고 탈 이온수로 37 : 1로 희석 한 3 % 질산 용액에 밤새 담근 다음 탈 이온수로 다시 헹구고 건조시킵니다.

1. 산 혼합물 : 유리 병에 37 % 염산 82.2mL에 트리클로로 아세트산 10g을 넣고 완전히 용해 한 다음 탈 이온수로 최종 부피를 100mL로 조정하십시오. 사용 전에 흔들어 주십시오. 또는 조직 소화를 위해 37% 염산만 사용하십시오.
   메모: 이 용액은 짙은 갈색 유리 시약 병에 보관할 때 최소 2 개월 동안 안정적입니다 .
   주의: 염산과 트리클로로 아세트산은 부식성이 있으며 농축 된 형태는 독성 산성 증기를 방출합니다. 산을 다룰 때는 항상 보호복, 내화학성 장갑, 화학 물질 비말 고글을 착용하십시오. 흡입을 피하고 항상 흄 후드 아래에서 산을 취급하십시오.
2. 포화 아세트산 나트륨 : 유리 병에 228g의 무수 아세테이트 나트륨 400ml를 넣고 실온에서 밤새 교반합니다. 용액을 하루 동안 그대로 두었다가 침전시킵니다. 침전이 발생하지 않으면 소량의 아세트산 나트륨을 계속 첨가하십시오. 용액을 유리병에 보관하십시오.
3. 발색계 시약: 발색계 시약 1mL를 제조하려면 탈이온수 500μL와 농축(100%) 티오글리콜산 10μL에 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline disulfonic acid disodium salt 1mg을 넣고 완전히 용해합니다. 탈이온수로 최종 부피를 1mL로 구성합니다.
   메모: 필요한 만큼 발색 시약을 준비합니다. 이 솔루션은 빛으로부터 보호될 때 1개월 동안 안정적입니다.
4. Working Chromogen Reagent (WCR) : 5 부피의 포화 아세트산 나트륨과 5 부피의 탈 이온수에 1 부피의 Chromogen 시약을 추가합니다 .
   메모: 이 용액은 사용 당일에 신선하게 준비해야 합니다.
5. 스톡 철 표준 용액: 20mM 스톡 철 용액을 준비하려면 37% 염산 5,480μL가 포함된 250mL 부피 플라스크에 111.5mg의 카르보닐 철 분말을 넣습니다. 실온에서 하룻밤 동안 녹입니다(또는 끓는 물 욕조에서 배양합니다). 그런 다음 탈이온수로 용액을 최종 부피 100mL로 구성합니다.
   메모: 표준 용액은 단단히 밀봉된 용기에 보관할 경우 무기한 보관할 수 있습니다.
6. WISS(Working Iron Standard Solution): 13.5μL의 37% 염산을 500μL의 탈이온수에 첨가합니다. 10 μL의 Stock Iron Standard Solution을 추가하고 탈이온수(11.169 μg의 Fe/mL, 200 μM, AAS로 측정)로 최종 부피를 1 mL로 구성합니다.
   메모: 작업 솔루션은 사용 당일에 신선하게 준비해야 합니다.

2. 샘플 건조

1. 메스 칼날로 10-100mg 무게의 조직 샘플을 자릅니다. 작은 파라필름 조각(Fresh Weight)에 대한 분석/정밀 저울로 정확하게 무게를 잰다.
2. 플라스틱 핀셋을 사용하여 조직 조각을 24웰 플레이트(수분 증발을 위해 뚜껑을 열지 않음)에 넣고 65°C의 표준 인큐베이터에서 48시간 동안 건조시킵니다.
3. 또는 실험실 마이크로파 분해 오븐을 사용하여 조직 샘플을 건조합니다. 플라스틱 핀셋을 사용하여 무게를 잰 티슈 조각을 철분이 없는 테프론 컵에 넣고 전자레인지에서 말리십시오. 기기의 지침 설명서에 따라 작동 매개변수를 설정하십시오.
   메모: 참고로, 특정 분해 오븐(Table of Materials(재료표 참조)을 사용하여 간 샘플을 건조하기 위한 작동 매개변수는 표 1에 나와 있습니다.
4. 플라스틱 핀셋을 사용하여 건조된 각 조직 조각을 분석/정밀 저울 내부의 작은 파라필름 조각 위에 놓고 정확하게 무게를 잰다(건조 중량).

3. 시료 산성 분해

1. 플라스틱 핀셋을 사용하여 건조된 각 조직 조각을 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
2. 산 혼합물 1mL를 넣고 마이크로 원심분리기 튜브를 닫습니다. 조직이 생략된 것을 제외하고는 같은 방법으로 산 블랭크를 준비합니다.
   주의: 산 혼합물은 부식성이며 독성 증기를 방출합니다. 산 혼합물을 취급할 때는 보호복, 내화학성 장갑, 화학 물질 비말 고글을 착용하십시오. 흡입하지 말고 항상 흄 후드 아래에서 취급하십시오.
3. 마이크로 원심분리 튜브를 65°C의 인큐베이터에서 20시간 동안 배양하여 조직을 소화합니다.
4. 실온으로 냉각한 후 플라스틱 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 500μL의 투명(노란색) 산성 추출물(상등액)을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 투명한 상층액을 얻을 수 없는 경우 짧은 원심분리 스핀을 수행합니다.
   주의: 상등액은 산성이 높습니다. 상층액을 취급할 때는 보호복, 내화학성 장갑, 화학 물질 스플래시 고글을 착용하십시오. 항상 흄 후드 아래에서 취급하십시오.
   메모: 이 시점에서, 산 추출물은 비색 분석실험을 위해 즉시 이용되거나 나중에 사용을 위해 -20 °C에 얼어붙을 수 있습니다. 냉동 샘플을 실온으로 완전히 해동하고 사용하기 전에 와류로 가열합니다.

4. 발색

1. 표 2에 표시된 대로 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 또는 더 높은 처리량을 위해 평평한 바닥의 96웰, 투명하고 처리되지 않은 폴리스티렌 마이크로플레이트에 직접 발색원 반응을 준비합니다. 모든 반응(acid blank, standard 및 sample)을 최소한 중복으로 준비합니다.
2. 실온에서 15분 동안 배양합니다.

5. 흡광도 판독

1. 분광 광도계 또는 플레이트 리더에서 탈이온수 기준에 대해 535nm의 파장에서 시료 흡광도를 측정합니다. 플레이트는 뚜껑을 열거나 뚜껑을 닫아 읽을 수 있습니다. 뚜껑이 있는 케이스에서 흡광도 판독값에 대한 간섭을 피하기 위해 측정 직전에 뚜껑에서 산성 증기가 방출되어 형성된 응결을 제거하십시오.
   메모: 탈이온수(기준)에 대해 판독된 산 블랭크의 광학 흡광도는 0.015 미만이어야 합니다. 표준물질 및 샘플의 광학 흡광도는 0.100에서 1.000 사이여야 합니다. 철 함량이 매우 높거나 매우 낮은 샘플의 경우, 산 추출물 (상등액) 및 diH₂O의 부피를 조정해야 할 수 있습니다 (표 2) : 흡광도가 1.0보다 큰 경우 더 작은 샘플 (상등액) 부피를 사용하십시오. 흡광도가 0.1보다 낮을 때는 더 높은 부피의 상등액을 사용하십시오. 각 샘플의 조직 철 함량을 계산할 때 샘플 부피(Vsmp)를 고려합니다(6단계 참조).

6. 조직 철 함량 계산

1. 다음 방정식을 사용하여 비헴 조직 철 함량을 계산합니다.
   
   조직 철분(μg/g 건조 조직) = 방정식 1
   AT = 테스트 샘플의 흡광도
   AB = 산 블랭크의 흡광도
   AS = 표준의 흡광도
   Fes = WISS의 철 농도 (μg Fe/mL)
   W = 건조 조직의 무게 (g)
   Vsmp = 시료 부피(표 2의 상층액을 mL로 변환한 다양한 부피)
   Vf = 65°C에서 하룻밤 배양 후 산 혼합물의 최종 부피(산 부피와 건조 조직 부피(mL)에 해당, 시료 중량이 크게 다르지 않은 경우 1mL≈ 일정한 부피로 가정)
   Vstd = 철 표준 부피(표 2의 WISS의 부피를 mL로 변환)
   Vrv = 최종 반응 부피(표 2의 총 부피를 mL로 변환)

표 1: 여기에 사용된 마이크로파 소화 오븐에서 간 건조를 위한 작동 매개변수

분 분 분 분 분 분 분 분 분 의 의 의 의 의 의

전력 650W(%):	10	15	20	25	30
압력 (PSI):	0	0	0	0	0
시간(분):	10	15	30	30	40
압력에서 시간(TAP):	0	0	0	0	0
팬:	50	50	50	50	50

표 2: 1.5mL 튜브 또는 96웰 플레이트에서 발색 반응 준비.

년 명 명 년 년 명 명 년 년 년 명 조 조 의 명 조 조 의 명 의

		WCR(μL)	산 혼합물 (μL)	상등액(μL)	지혜 (μL)	디H2O (μL)	총 부피(μL)
1.5 mL 튜브	산성 공백	1000	150			150	1300
	표준	1000	150		150		1300
	견본	1000		변수		변수	1300
96웰 마이크로플레이트	산성 공백	150	22.5			22.5	195
	표준	150	22.5		22.5		195
	견본	150		변수		변수	195

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96 웰 UV 투명 플레이트	사르슈테트	82.1581.001
분석 저울	컨	ABJ 220-4M
무수 아세트산 나트륨	머 크	106268
바토페난트롤린 설포네이트(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린 디설폰산)	시그마-알드리치	나1375
C57BL/6 마우스(Mus musculus)	찰스 리버 연구소
카르보닐 철 분말, ≥99.5%	시그마-알드리치	44890
폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)의 일회용 큐벳	폭스바겐	634-0678피
이중 증류수, 멸균수	B. 브라운	0082479E
형광 마이크로플레이트 리더	BioTek 기기	FLx800
염산, 37%	시그마-알드리치	258148
전자레인지 소화 오븐과 흰색 테프론 컵	증권 시세	MDS-2000
질산	피셔 사이언티픽	15687290
오븐	바인더	ED115
설치류 차우	할란 연구소	2014년대	철분 175mg/kg을 함유한 Teklad Global 14% 단백질 설치류 유지 다이어트
농어(Dicentrarchus labrax)	손리오난사
농어 피드	스크레팅	L-2 알터나 1P
단일 빔 UV-Vis 분광 광도계	시마즈	UV 미니 1240
티오글리콜산	머 크	100700
트리클로로아세트산	머 크	100807