$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. OC 창시자 확장
- 20ng/mL M-CSF를 포함하는 완전한 α-MEM(10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% 암포테리신 B)에서 PBMC를 재현탁합니다. 2.5 x 105 cells/cm2의 밀도로 PBMC를 파종합니다. 일반적으로 15-20mL의 신선한 혈액에서 분리된 세포는 하나의 75cm2 플라스크(1.5-2 x 107 세포)에 파종할 수 있습니다.
- 부착된 세포가 원하는 농도에 도달할 때까지 3일마다 20ng/mL M-CSF를 함유한 신선하고 완전한 α-MEM을 세포에 공급합니다. 일반적인 수율은 세포가 95% 융합될 때 1.5-2 x106 cells/flask입니다. 일반적으로 확장 기간은 6일입니다.
메모: 전구체의 파골형성 가능성은 배양 시간이 길어짐에 따라 감소할 수 있습니다.
2. 인산칼슘 코팅판에서 파골형성 유도
- 세포 접착을 촉진하기 위해 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 50μL의 FBS가 포함된 인산칼슘(CaP) 코팅 플레이트를 배양합니다.
- OC 전구체를 분리하려면 PBS로 플라스크를 두 번 세척하여 사체 또는 비부착 세포를 제거합니다. 75cm2 플라스크당 트립신 4mL(재료 표)를 30분 동안 추가합니다.
- 완전한 α-MEM 4mL를 추가하여 분해를 중단하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 조심스럽게 분리한 다음 세포를 50mL 튜브로 옮깁니다.
- Neubauer 챔버 또는 이와 유사한 것을 사용하여 총 세포 수를 결정합니다.
- 350 x g에서 7분 동안 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다.1 x 106 cells/mL의 농도를 얻기 위해 20ng/mL M-CSF 및 20ng/mL RANKL을 포함하는 충분한 완전한 α-MEM에 펠렛을 재현탁합니다.
- CaP로 코팅된 96-웰 플레이트와 웰(2 x 10,5 cells/well)당 200μL의 세포 현탁액을 피펫으로 흡입합니다.
- 원하는 기간 동안 또는 실험 설계와 관련된 원하는 시약으로 OC 전구체를 배양합니다. 일반적으로 많은 수의 크고 다핵이 있는 OC는 6일 후와 흡수 구덩이가 형성될 때 관찰될 수 있습니다. 3일마다 20ng/mL M-CSF 및 20ng/mL RANKL을 함유한 완전한 α-MEM 배지를 세포에 공급합니다.
- 배양이 끝나면 PBS로 세포를 두 번 세척하고 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정한 다음 PBS로 다시 세척합니다.
- 형광 염색을 위해 고정식 OC를 직접 사용하거나 4°C에서 보관하십시오.
3. OCs 및 인산칼슘 코팅의 형광 염색
- 고정된 세포를 투과화 완충액(PBS의 0.1% Triton)으로 5분 동안 배양합니다.
- PBS에서 100μL의 AlexaFluor 546 표지된 팔로이딘 용액으로 액틴 필라멘트를 염색하고 염색 용액을 흡입합니다. Hoechst 33342 염색 용액 100μL(PBS의 경우 10μg/mL)를 10분 동안 첨가하여 핵을 염색합니다. DAPI도 사용할 수 있습니다.
- PBS에서 100μL의 10μM 칼세인으로 10분 동안 CaP 코팅을 염색하고 PBS로 3회 세척하고 이미지를 촬영합니다.