배양된 세포의 기질 산화 분석: 포획된 CO2의 방사성 신호를 측정하여 세포의 기질 산화를 정량화하는 체외 분석

초록

출처: Song, C. et al., ¹⁴CO₂ Trapping을 사용한 In Vitro 에너지 기판 산화 평가. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 ¹⁴개의 C-방사성 표지 기판을 사용하여 기판 산화 중에 방출되는 CO₂에 대한 정량화 기술을 보여줍니다. 방출 된 ¹⁴CO₂ 는 알칼리 용액에 갇혀 섬광 계수기에 의해 정량화됩니다. 서로 다른 기질의 산화는 조직마다 다르며 조직의 병태생리학적 상태를 반영합니다.

프로토콜

방사성 물질(RAM)의 사용은 각 기관의 지정 안전 위원회의 사전 승인이 필요합니다.

1. ¹⁴개의 C 표지 기판에 대한 원액 준비

1. BSA 11g과 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 33.1mL를 혼합하고 BSA가 완전히 용해될 때까지 ~3시간 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 4mM 소 혈청 알부민(BSA) 원액을 만듭니다. 사용하기 전에 BSA 원액을 70°C 수조에서 데우십시오.
2. 지정된 RAM 작업 후드에서 뚜껑을 열고 8시간 동안 바이알에서 50μCi ^14C-oleate(에탄올 중 50μCi/μmol)를 자연 건조합니다. 312.5 μL의 H₂O를 첨가 한 다음 3.5 mg (11.5 μmol)의 올레 산나트륨을 첨가합니다. 철저히 섞는다.
3. 생성된 용액을 수조에서 70°C로 가열합니다. 예열된 BSA 원액 0.9375mL를 추가하여 10mM 고온 올레에이트 원액을 생성합니다(¹⁴C-올레이트와 비표지 올레이트의 1:11.5 비율 포함). 원액을 분취하여 장기간 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관하십시오.
4. 해동 직후 ¹⁴C-글루코스와 ¹⁴C-글루타민을 사용하십시오.

2. ¹⁴개의 C-표지 기질을 포함하는 배지의 제조

참고: 매체에서 에너지 기판의 안정적인 농도를 보장하려면 사용 직전에 새로운 기판을 추가한 상태에서 맞춤형 매체를 사용해야 합니다. 여기에는 포도당, 피루브산염, 글루타민, 페놀 레드 또는 중탄산나트륨이 없는 맞춤형 MEMα(Minimum Essential Medium)가 사용됩니다. 그러나 각 세포 유형에 대해 최적의 배지를 결정해야 합니다.

1. 8.67g의 중간 분말을 정제수 1L에 재구성합니다. pH 7.4를 달성하기 위해 2.2g의 중탄산나트륨을 추가하고 0.22μm 진공 여과를 사용하여 용액을 여과합니다.
2. 신선한 성분을 첨가하여 최종 농도 5.5mM 포도당, 2mM 글루타민, 1mM 피루브산 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 가진 완전한 배지(cMEMα)를 얻습니다. 또한 cMEMα에 100mM L-카르니틴과 10μM HEPES를 첨가하여 지방산 산화를 촉진합니다.
3. 사용 직전에 ¹⁴개의 C 표지 기판을 갓 준비한 cMEMα에 첨가하여 고온 매체를 만듭니다. 올레산염 고온 매체를 만들려면 100μM 올레산염(1:100 희석, 최종 방사능 0.4μCi/mL)의 최종 농도를 위해 10mM 고온 올레산염 원액을 cMEMα에 추가합니다.
   메모: 1:11.5 비율의 고온 및 차가운 올레이트(단계 1.3 참조)를 포함하는 10mM 핫 올레이트 스톡을 사용하여 방사성 물질의 양을 최소화하면서 배지에서 총 100μM 올레이트의 생리학적 수준을 달성합니다.
4. 70°C로 예열된 4mM BSA 원액 6mL와 빠르게 혼합하기 전에 완전히 용해될 때까지 70°C의 수조에서 2mL의 H₂O에 24.36mg의 올레산나트륨을 첨가하여 10mM의 라벨이 없는 올레에이트 스톡을 만듭니다.37°C 수조로 1시간 동안 옮기고 0.22μm 필터를 통해 필터링합니다. 장기 사용을 위해 -20 °C에서 부분 표본으로 보관합니다.
포도당을
5. 고온 매체로 만들려면 ¹⁴C- 포도당을 1.333 μM (1 : 4,125 희석, 최종 방사능 0.4 μCi / mL)의 최종 농도에 첨가하십시오. 글루타민 고온 매체를 만들려면 ¹⁴C- 글루타민을 2 μM (1 : 1,000 희석, 최종 방사능 0.4 μCi / mL)의 최종 농도에 첨가하십시오.
6. 포도당 및 글루타민 고온 배지에 2.4단계에서 표지되지 않은 올레에이트의 10mM 원액을 보충하여 올레산 고온 배지에서와 동일한 100μM 올레산의 최종 농도를 달성합니다.

3. 세포의 준비

참고: 여기서는 Calvarial preosteoblasts와 bone marrow macrophage를 예로 사용합니다. 사용자는 적절한 프로토콜에 따라 선택한 세포 유형을 준비해야 합니다. 파일럿 실험에서 소화에 사용할 collagenase II의 농도를 최적화하면 효소 활성이 로트마다 다를 수 있습니다.

1. calvarial preosteoblasts의 분리 및 배양
   1. 출생 후 3-5일(P3-5) 새끼를 참수하여 희생하고 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 포함된 얼음처럼 차가운 DPBS로 옮깁니다.
   2. 피부와 연조직을 제거하여 갈바리아를 노출시킵니다. DPBS에서 주변 조직을 뒤에서 앞으로 잘라내어 중간 영역을 수집합니다(그림 1A). 핀셋을 사용하여 칼바리아의 내부와 외부 표면을 부드럽게 긁으면 다음 소화 시 세포가 분리되는 데 도움이 됩니다.
   3. DPBS에서 콜라겐분해효소 유형 II의 2mg/mL 및 4mg/mL 용액을 준비하고 새 0.22μm 필터로 각 용액을 여과합니다. 세척된 칼바리아를 먼저 2mg/mL 콜라겐분해효소 용액으로 15분 동안 소화하고 분해 용액을 버립니다. 세척된 샘플을 4mg/mL 콜라겐 분해 효소 용액에 넣고 매번 15분 동안 3회 분해하여 분해 용액을 모으고 저장합니다.
   4. 70μm 세포 스트레이너를 통해 분해 용액을 여과하고 300 × g에서 5분 동안 여과액을 원심분리합니다. 10% FBS 및 P/S를 함유한 cMEMα(2.2단계 참조)에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
   5. 10cm 플레이트에 4 ×^{10 4} cells/cm²에서 세포를 세고 시드합니다. 37 °C 인큐베이터에서 5% CO₂로 3일 동안 세포를 배양합니다.
   6. 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA로 세포를 해리합니다. 10% FBS 및 P/S를 함유한 cMEMα를 7.5 × 10⁵/cm²에서 사용하여 24웰 세포 배양 플레이트에서 세포를 계수하고 시딩합니다. 분석 전에 세포 계수를 위해 기질당 세포 유형당 최소 4개의 웰을 시딩하고 각 세포 유형에 대해 최소 3개의 추가 웰을 시딩합니다.
   7. 기질 산화 분석 전에 37°C에서 밤새 세포를 배양합니다.
2. BMMs
   의 격리 및 배양 참고: BMM의 배양에는 대식세포 집락자극인자(M-CSF)가 필요하며, 이는 재조합 단백질로 상업적으로 구입할 수 있습니다. M-CSF를 발현하도록 설계된 세포주 CMG14-12의 조건화된 배지는 여기에 사용된 경제적인 대안입니다.
   1. 근육과 결합 조직을 제거한 후 8주 된 생쥐에서 대퇴골과 경골을 수집합니다. 날카로운 가위로 뼈의 양쪽 끝을 잘라 버립니다.
   2. 한쪽 대퇴골과 한쪽 경골의 골수를 10cm 페트리 접시에 넣고 10% FBS, P/S 및 10% CMG14-12 컨디셔닝 배지(BMM 배지)가 포함된 15mL의 cMEMα가 들어 있는 23G 바늘이 장착된 주사기로 씻어냅니다. 페트리 접시의 세포를 37 ° C 인큐베이터에서 5 % CO₂로 배양합니다.
   3. 3일 후 배양 배지를 버리고 DPBS로 헹굽니다. 부착된 세포를 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA로 5분 동안 해리합니다. 세포 펠릿을 원심분리하고 BMM 배지에 재현탁합니다.
   4. 3.1.6에 설명된 것과 동일한 방식으로 7.5 × 10⁵/cm²에서 24웰 세포 배양 플레이트의 세포를 세고 시딩합니다. 분석을 시작하기 전에 37°C에서 BMM 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다.

4. CO₂ 트랩을 사용한 기질 산화 분석

참고: 분석을 시작하기 전에 80-90% 합류점을 달성하기 위해 각 세포 유형에 대해 적절한 파운딩 밀도를 결정해야 합니다. 세포 밀도는 세포의 대사 상태에 영향을 줄 수 있습니다.

1. 여분의 웰에 있는 세포를 DPBS로 두 번 세척합니다. 0.25% 트립신-EDTA로 세포를 해리하고 DPBS에 재현탁된 20μL 세포를 즉시 사용 가능한 상업용 염료 용액 20μL와 혼합합니다. 자동화된 셀 카운터로 살아있는 셀의 수를 결정하고 최종 계산을 위해 그 수를 기록합니다.
2. DPBS로 분석 웰의 세포를 두 번 세척합니다. RAM 지정 조직 배양 후드의 각 분석 웰에 500μL의 고온 배지를 추가합니다. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 RAM으로 지정된 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 세포를 배양합니다.
3. 배양하는 동안 여과지를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 캡 내부 영역보다 약간 큰 원형 조각으로 자르고 종이를 캡에 꼭 맞게 삽입합니다(그림 1B). 각 튜브에 200μL의 1M 과염소산을 추가하고 캡 내부에 장착된 여과지에 20μL의 수산화나트륨을 추가합니다.
4. 세포를 배양한 후 각 웰에서 400μL의 배양 배지를 준비된 튜브로 옮기고 즉시 캡을 닫습니다. 튜브를 튜브 랙에 넣고 실온에서 1시간 동안 그대로 둡니다.
5. 배양 중에는 각 튜브에 섬광 바이알을 설정하고 섬광 유체 4mL를 채웁니다. 각 여과지 조각을 섬광 바이알에 옮기고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
6. 조직 배양 후드, 수조(¹⁴C-oleate 준비에 사용), 냉장고, 인큐베이터, 싱크대, 접지 및 기타 작업 영역에서 잠재적인 RAM 오염에 대한 닦음 테스트를 수행합니다. 종이 물티슈를 섬광 유체가 들어 있는 섬광 바이알에 넣습니다.
7. 섬광 계수기로 섬광 바이알에서 ^14C방사능을 측정합니다. 읽기 결과를 기록합니다. 필요한 경우 방사선 안전 지침에 따라 작업 환경의 오염을 제거하십시오.

결과

그림 1: CO₂ 포획 분석 및 칼바리아 해부 다이어그램. (A) 주황색 점선 삼각형으로 표시된 칼바리아의 중간 영역은 세포 분리를 위해 수확됩니다. (B) 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브는 CO₂ 포집(1단계)에 사용됩니다. 여과지(설명을 위한 파란색 종이)는 튜브 캡에 맞게 절단됩니다(2단계). 뚜껑을 닫기 전에(단계 4) 각 튜브의 세포 배양에서 추출한 고온 매체 400μL에 1M 과염소산 200μL를 추가하고 여과지에 NaOH 20μL를 추가합니다(단계 3).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22μm 필터	시그마-알드리치	SLGVM33RS	BSA 용액을 필터링하는 데 사용됩니다.
0.25% 트립신-EDTA	지브코	25200056	세포 배양에서 세포 해리 격판덮개
1.5 mL Eppendorf 튜브	PR1MA	홍보 MCT17 RB	반응 배양에 사용
10cm 접시	증권 시세	93100	세포 배양에 사용
10mL 주사기	BD (영어)	302995	long 에서 골수를 씻어내는 데 사용됩니다. 뼈
10% FBS	애틀랜타 생물학 제제	S11550	세포 배양 배지 준비용
14C -포도당	퍼킨엘머	NEC042X050UC	뜨거운 매체를 만드는 데 사용됩니다
14 C-글루타민	퍼킨엘머	NEC451050UC	뜨거운 매체를 만드는 데 사용됩니다
14 C-올레이트	퍼킨엘머	NEC317050UC	뜨거운 매체를 만드는 데 사용됩니다
23 G바늘	BD (영어)	제305120	long 에서 골수를 씻어내는 데 사용됩니다. 뼈
24웰 플레이트	증권 시세	92024	세포 배양에 사용
70 μm 셀 스트레이너	미시(MIDSCI	70셀	동안 상등액을 필터링하는 데 사용됩니다. 충혈 소화
아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 (AO/PI) 염료	Nexcelom 생명과학	CS2-0106 (영문	살아있는 세포를 염색하여 seed 밀도
소 세럼 Ablumin	Proliant 생물학적 제제	68700	지방산 접합에 사용
셀로미터 자동 2000	Nexcelom 생명과학		생존 가능한 세포의 수를 결정합니다.
원심 분리기	써모 피셔	레전드 마이크로 21R	세포를 펠릿화하는 데 사용됩니다.
콜라겐분해효소 II형	워 딩 턴	LS004176	조직에서 세포 분리
사용자 지정 MEM 알파	지브코	제품 번호: ME 18459P1	사용자 지정 핫 미디어를 만드는 데 사용됩니다
Dulbecco의 인산염 완충 생리	지브코	10010023	시약을 용해하고 묽게 하는 데 사용, 그리고 문화 접시를 씻습니다
여과지	밀리포어-시그마	WHA1001090	수산화나트륨으로 CO 2
포도당	시그마-알드리치	G7528 (영어	사용자 정의 미디어를 만드는 데 사용됩니다.
헤페스	지브코	15630080	세포 배양 중 CO 2
L-카르니틴	시그마-알드리치	C0283	지방산 산화를 위해 보충
L-글루타민	시그마-알드리치	G3126 (영어	사용자 정의 미디어를 만드는 데 사용됩니다.
MEM 알파	열	A10490	세포 배양 배지
파라필름	Pecheney 플라스틱 포장	오후998	세포 배양 접시를 밀봉하는 데 사용됩니다
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔	15140122	세포 배양 시 오염 방지
과염소산	시그마-알드리치	244252	대사 중 CO 2 방출 시험
피루브산	시그마-알드리치	P5280	사용자 정의 미디어를 만드는 데 사용됩니다.
섬광 카운터	벡크만 쿨터	LS6500	여과지
섬광 유체	MP 바이오메디컬	882453	RAMs 에서 방출되는 에너지를 흡수합니다. 그리고 그것을 섬광으로 다시 방출합니다.
섬광 바이알	피셔 사이언티픽	03-337-1	섬광을 위한 반응 용기 유동체
소다	시그마-알드리치	S5761	중간용 밸런스 버퍼
수산화나트륨	시그마-알드리치	58045	metaboilc 분석 중 CO2 트랩
올레산나트륨	산타크루즈	사우스 캐롤라이나-215879	BSA 공액 지방산 준비
진공 여과 1000	증권 시세	99950	필터 cMEMα

표시기 년 . . . 호 표시기 ) ) 년 . 트랩 ) 트랩 ) . (영문) 년 표시기