단백질 상 분리 분석: 제브라피시 유충의 척추 운동 뉴런에서 돌연변이 RNA 결합 단백질 상 분리를 위한 광유전학적 방법

초록

출처: Asakawa, K. et al. 제브라피시 유충의 척추 운동 뉴런에서 TDP-43의 광유전학적 위상 전이. J. Vis. 특급 (2022년)

이 비디오에서는 감광성 올리고머화 도메인에 융합된 본질적으로 무질서한 영역을 구성하는 세포 내 단백질이 청색광 노출을 통해 유도되어 멤브레인이 없는 액체와 같은 응축물로 자가 결합하는 상 분리 분석에 대해 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 청색광 조명용 LED 준비

1. 태블릿/휴대폰에 설치된 관련 응용 프로그램을 사용하여 LED 패널을 켭니다. 분광계의 프로브를 6웰 접시의 빈 우물에 넣고 응용 프로그램을 통해 ~456nm에서 최고조에 달하는 파장으로 LED 조명을 조정합니다. 광 파워 미터의 광학 센서를 빈 우물에 놓고 LED 조명의 전력을 조정합니다(~0.61mW/cm²). LED 조명 설정은 저장할 수 있으며 응용 프로그램에서 검색할 수 있습니다.
2. 28°C에서 인큐베이터에 접시/LED 패널 설정을 도입합니다.물고기 이미징이 48hpf에서 시작되기 전에 이 단계를 완료합니다.

2. 광유전학 TDP-43을 발현하는 제브라피쉬 유충의 이미징

1. Plan-Neofluar 5x/0.15 대물 렌즈가 장착된 상피 형광 현미경을 사용하여 척추 운동 기둥의 RFP(opTDP-43h) 또는 EGFP(EGFP-TDP-43z) 형광을 기반으로 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질전환 물고기를 47hpf 이전 이상으로 선택합니다.
2. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질전환 어류를 탈부착합니다.
3. 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염 250μg/mL를 함유한 1% 저용융 온도 아가로스를 42°C에서 예열합니다.
4. 동일한 농도의 트리케인을 함유한 E3 완충액에서 48hpf로 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] 이중 형질전환 물고기를 잠시 마취합니다.
5. 예열 된 1 %의 낮은 용융 온도의 아가로 로즈를 실온의 유리베이스 접시에 한 방울 떨어 뜨립니다. 유리 접시에 있는 돔 모양의 아가로스 방울의 직경은 8-10mm입니다.
6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취된 생선을 유리 베이스 접시의 낮은 용융 온도의 아가로스에 넣은 다음 몇 번 피펫팅하여 혼합합니다. 물고기와 함께 아가로스에 추가되는 E3 완충액의 양을 최소화합니다.
7. 아가로스가 응고되는 동안(일반적으로 ~1분) 주사기 바늘을 사용하여 물고기를 옆으로 눕혀 척수가 적절한 수평 위치에 있는지 확인합니다. 응고 후 돔 모양의 아가로스 장착 물고기에 E3 완충액 몇 방울을 떨어뜨립니다.
8. 개구수가 1.00인 20x 침수 대물 렌즈가 장착된 컨포칼 현미경으로 픽셀당 4.0μs(픽셀당 12비트)의 스캔 속도, 대물렌즈의 슬라이스당 1.0μm의 스텝 크기 및 여기/방출 파장의 조합을 사용하여 스캔하여 척수의 연속 컨포칼 z-절편을 획득합니다. 채널 1) EGFP의 경우 473/510nm 및 채널 2) mRFP1.
   의 경우 559/583nm 메모: 물고기의 복부 쪽에 있는 배설물은 관심 영역(ROI)에 참조로 포함되며, 이는 시점에 걸쳐 척추 분절(레벨 16-17)을 식별하고 비교하는 데 도움이 됩니다.
9. 이미징이 완료되는 즉시 주사기 바늘로 아가로스를 조심스럽게 깨뜨려 아가로스에서 물고기를 제거합니다. 물고기가 아가로스에 묻히는 시간을 가능한 한 짧게 유지하되 <30분 동안 아가로스 포딩은 물고기의 생존 능력에 영향을 미치지 않습니다.

3. 청색 발광 다이오드(LED) 조명의 필드 조명에 의한 opTDP-43h 발현 물고기의 광 자극

1. 7.5mL의 E3 버퍼를 웰에 추가하고 이미징된 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질전환 물고기를 웰에 넣습니다. 접시와 LED 패널을 스페이서로 5mm 간격을 유지하여 LED 패널에 6웰 접시를 놓습니다(예: 5개의 슬라이드 유리잔을 쌓은 경우).
2. 파란색 LED 표시등을 켭니다. 조명이 없는 대조군 물고기가 필요할 때(즉, 어두운 조건에서) Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질전환 물고기 중 일부를 알루미늄 호일로 덮인 별도의 6웰 접시에 보관하십시오.
3. 조명 후(예: 그림 1의 72hpf에서 24시간 동안) 2.3 - 2.9 단계를 반복하여 조명된 물고기의 척수를 이미지
화합니다.

결과

그림 1: 광 자극 전과 후의 opTDP-43h와 EGFP-TDP-43z의 비율계량 비교. (A) 48 및 72 hpf에서 4개의 단일 mnr2b 양성 세포의 somas를 포함하는 ROI는 EGFP-TDP-43z 신호를 기반으로 도출되었으며 자홍색으로 표시되었습니다. 직사각형 ROI(bg)는 배경 신호(배경 ROI)를 빼는 데 사용되었습니다. 그림은 Asakawa et al.에서 각색한 것입니다. (B) opTDP-43h에서 EGFP-TDP-43z까지의 상대 강도는 각 시점에서 각 셀에 대해 RFP/GFP 비율로 표시되었습니다. 별표로 표시된 셀 #1은 EGFP-TDP-43z 신호가 포화 상태이고 RFP/GFP 값이 과대 평가되었기 때문에 비율...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
컨포칼 현미경	올림푸스	FV1200
Epifluorescence microscope (에피 형광 현미경	자이스	액시오이미저 Z1
형광 실체현미경	라이카	MZ16FA
유리 베이스 접시	이와키	3910-035
부 화기	미	씨엔-25씨
LED 패널	Nanoleaf 리미티드	Nanoleaf AURORA 스마트 키트
대물 렌즈	올림푸스	XLUM플라플FL N 20×/1.00
대물 렌즈	자이스	플랜-네오플루아르 5배/0.15
광 파워 미터	히오키	3664
광학 센서	히오키	9742-10
6웰 접시	송골매	353046
분광계 프로브 BLUE-Wave	StellerNet 주식 회사	바이스-50
주사기 바늘	데루모	NN-2725R
트리케인	시그마-알드리치	A5040
NuSieve GTG 아가로스	론자	50181

) 년 년 년 년