Small Molecule Nematicides 스크리닝 분석: Ditylenchus dipsaci 에 대한 잠재적 선충제를 스크리닝하는 중간 처리량 방법

초록

출처: Cammalleri, S. R., et al. 식물 기생 선충 Ditylenchus dipsaci의 배양 및 스크리닝. J. Vis. 특급. (2022).

이 비디오에서는 선충에 대한 저분자 선충제의 효능을 확인하기 위한 스크리닝 분석을 시연합니다. 선충제는 노출 후 샘플에서 이동성 선충의 수를 감소시키는 경우 효과적인 것으로 간주됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 체외 소분자 스크린

1. 아래 단계에 따라 분석 플레이트를 준비합니다.
   1. 오토클레이브 증류수를 멸균 트러프에 붓고 멀티채널 피펫을 사용하여 트러프에서 40μL의 증류수를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰로 분배합니다.
2. 고정 도구를 준비하고 화학 물질을 추가합니다.
   1. 실험실 벤치의 분젠 버너 불꽃 근처에 피너 트레이(재료 표 참조)를 설정합니다. 핀 세척 용액 25mL, 50% DMSO 35mL(물 중), 증류수 45mL, 70% EtOH 55mL 및 95% EtOH 65mL를 연속적인 피너 트레이에 추가합니다. 각 트레이 앞에 블로팅 페이퍼를 한 장씩 놓습니다.
   2. 세척액에 있는 핀을 펌핑하고 용액에서 핀을 위아래로 세 번(3회) 움직여 고정 도구를 청소합니다. 이 프로토콜에서 '3x' 및 '10x'는 솔루션에서 피너를 각각 3회 또는 10회 위아래로 움직이는 것으로 정의됩니다. 압지의 핀을 닦아냅니다. 이 절차를 한 번 더 반복합니다.
      1. 그런 다음 핀을 증류수로 3번 헹구고 핀을 닦습니다. 절차를 한 번 더 반복합니다.
      2. 마지막으로 핀을 95% EtOH로 3번 헹구고 핀을 블롭롭합니다. 한 번 더 반복합니다. 피너에 불을 붙이고 에탄올이 증발하도록 합니다.
   3. 96웰 화학 원료 플레이트의 화학 물질을 화학 플레이트에 3x를 핀으로 고정한 다음 핀 10X를 분석 플레이트에 옮겨 분석 플레이트에 추가합니다. 세척액 앞의 종이에 묻히십시오.
   4. 다음 순서로 플레이트를 세척하고 그 사이에 블로팅 페이퍼를 블롭팅하여 플레이트를 청소합니다: 50% DMSO 3배(1회), 증류수 3배(1회), 75% EtOH 3배(1회), 95% EtOH 3배(2회). 피너에 불을 붙이고 에탄올이 증발하도록 합니다.
   5. 모든 고정이 완료되면 1.2.2단계를 반복합니다.
      메모: 스크리닝은 60μM의 최종 농도에서 수행되었습니다.
3. 웜 추가
   1. 먼저 재현탁한 다음 저유지율 팁을 사용하여 5 μL를 관찰용 슬라이드에 피펫팅하여 컬렉션에서 선충의 수를 계산합니다. 해부 현미경을 사용하여 5 μL의 선충 수를 계산합니다.
      1. 멸균 증류수를 사용하여 농도를 2 worms/μL로 조정합니다. 멀티채널 피펫과 트로프를 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 10μL(~20개의 웜)를 추가합니다.
         메모: 약 15,000 D. dipsaci 선충은 설명된 배양 및 수집 방법을 사용하여 배양 플레이트당 수집됩니다. 우물당 20개의 웜이 사용되는데, 그 수가 적기 때문에 모바일 및 부동식 웜을 명확하게 시각화하고 설명할 수 있기 때문입니다.
   2. 실험실 포장 필름으로 플레이트를 밀봉하고 젖은 종이 타월로 감쌉니다. 상자에 넣고 200rpm으로 설정된 20°C 진탕 인큐베이터의 접착 패드에 부착합니다. 여분의 젖은 종이 타월을 추가하여 접시가 상자 안에 안정되었는지 확인하여 접시의 움직임을 최소화하십시오.

2. 데이터 수집 및 분석

1. 5일째 되는 날의 플레이트를 해부 현미경으로 관찰합니다. DMSO 용매 대조군 및 약물 처리된 웰에서 D. dipsaci의 모바일 수와 총 수를 계산합니다.
   1. 웜이 상대적으로 움직이지 않는 경우 웰에 최종 농도 40mM에 1M NaOH 2μL를 추가하여 움직임을 자극합니다.
      메모: NaOH를 추가하면 웜이 즉시 움직이며 5분 이내에 확인해야 합니다. 모바일 웜의 수와 총 웜 수는 모바일 웜의 비율을 계산하는 데 사용됩니다. 분석의 길이는 화면의 목적에 따라 변경될 수 있습니다.
2. 모바일 웜의 비율을 계산합니다. D. dipsaci 스크린에서 재현 가능하게 0% 모바일 웜을 산출한 웰은 강한 히트로 분류됩니다.
   메모: 해부 현미경의 스테이지에서 플레이트가 장기간 노출되는 것은 광원이 플레이트를 가열하고 생물학적 분석에 다양한 효과를 유발할 수 있기 때문에 피할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50mL 비커	파이렉스	CLS100050
96웰 플레이트	사르슈테트	83.3924
알루미늄 호일	알칸 플러스
해부 범위	라이카	라이카 MZ75
디엠소	시그마-알드리치	472301-500ML
유리 슬라이드	마그나	60-1200
보푸라기가 없는 블로팅 페이퍼	V&P 사이언티픽	부통령 522-100
저유지력 피펫 팁(200uL)	랩포스	1159분 44
멀티채널 피펫	Eppendorf research plus	3125000036
나오	시그마-알드리치	S8045-500G
파라필름	베미스	미세먼지-996
핀 세척 용액	V&P 사이언티픽	VP110A
피너	V&P 사이언티픽	VP381N은
피너 린스 트레이	V&P 사이언티픽	부사장 421
Reagent reservoir with lid for multichannel pipettes (멀티채널 피펫용 뚜껑이 있는 시약 저장장치)	시그마-알드리치	BR703459
쉐이킹 인큐베이터	뉴브런즈윅 사이언티픽	나26

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