In vitro mineralization assay: Alizarin Red S 염색 및 추출에 의한 뼈 이식 대체체의 골아세포 칼슘 침전물을 정량화하는 비색 방법

초록

출처: Kampleitner, C. et al. 뼈 재생을 위한 생체 재료에 대한 생물학적 호환성 프로파일. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서는 음이온 성 염료 인 Alizarin Red S를 사용하여 조골 세포 분비 칼슘 침전물을 검출하는 방법을 설명합니다. 배양된 조골세포를 먼저 염색한 다음 칼슘 침전물의 비색 정량화 또는 조골세포 광물화 정도를 위해 염료를 회수합니다.

프로토콜

1. 골아세포 광물화 분석

1. 골아세포(OB)를 추가하기 전에 37°C 및 5% CO₂의 24웰 현탁액 배양 플레이트에서 1mL의 뼈 성장 배지(BGM) 중 14mm 직경의 β β-TCP(Tricalcium Phosphate) 디스크를 24시간 동안 사전 배양합니다. 대조군에는 표준 조직 배양 플레이트를 사용하고 생체 재료 샘플에는 현탁 배양 플레이트를 사용하여 세포가 플라스틱에 부착되는 것을 방지합니다.
2. 사전 배양 배지를 흡입한 다음 BGM에서 기본 마우스 OB를 다시 현탁합니다. 8.8 x 10⁴ OBs/cm²를 24웰 현탁액 배양 플레이트의 사전 배양된 β-TCP 디스크에 추가하고, 대조군의 경우 24웰 조직 배양 플레이트(1mL/웰)에 추가합니다. OB는 조직 배양 플레이트 또는 생체 재료 샘플에 부착됩니다.
3. OB를 첨가한 후 24시간 후 BGM, 50μg/mL 아스코르브산 및 5mM β-글리세로포스페이트를 함유한 골생성 광물화 배지(MM) 1mL로 BGM을 교체하고 37°C 및 5% CO₂에서 14일 동안 배양합니다. 각 웰에 새로 준비된 MM 1mL로 배지를 2-3일마다 교체하십시오.

2. Alizarin Red S(ARS)로 염색하여 평가한 골아세포 광물화

1. MM을 첨가한 후 14일 후에 1차 OB가 포함된 웰에서 배양 배지를 흡입하고 RT에서 0.5mL의 1x PBS로 2회 헹굽니다.PBS를 흡인하고 10% 완충 포르말린 용액 0.5mL를 RT에서 10분 동안 첨가하여 세포를 고정합니다.
2. 일회용 피펫으로 10% 완충 포르말린을 흡입하고 0.5mL의 초순수로 두 번 세척합니다.
3. 고정 OB에 초순수에 용해된 40mM ARS 염색 용액(pH 4.2) 0.25mL를 추가하고 셰이커에서 10분/분 동안 상온에서 플레이트를 100회 쉐이크합니다.
4. 일회용 피펫으로 염색 용액을 흡입하고 초순수 1mL로 헹굽니다. 이 단계를 5-10회 반복하여 비특이적 염색을 제거합니다.
   메모: 헹굼 용액은 색이 없어야 합니다.
5. 초순수를 흡입하고 차가운 PBS 1mL를 추가합니다. 상온에서 플레이트를 10분 동안 셰이커에서 100회 쉐이크/분으로 배양합니다.
6. PBS를 흡인하고, 염색된 β-TCP 디스크를 새 우물로 옮기고, 평판 스캐너로 플레이트를 스캔하여 광물화를 기록합니다.
7. 0.25mL의 10% 세틸피리디늄 클로라이드 용액을 추가하고 셰이커에서 15분 동안 상온에서 100회 쉐이크/분으로 플레이트를 배양하여 ARS 염료를 추출합니다.
8. 상층액을 1.5mL 튜브로 옮기고 17,000 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리합니다.
9. 10% 세틸피리디늄 클로라이드 용액을 1:10–1:20의 희석 비율로 추출물에 첨가하고 샘플(300μL)을 10% 세틸피리디늄 클로라이드만 함유된 두 개의 빈 웰이 포함된 96웰 플레이트에 추가합니다.
10. 40mM ARS 염색 용액(pH 4.2)을 10% 세틸피리디늄 클로라이드 용액으로 희석하여 표준 곡선을 생성함으로써 4 - 400μM 범위의 7가지 ARS 참조 표준물질을 준비합니다.
11. 300μL의 참조 표준물질을 96웰 플레이트에 중복으로 추가합니다.
12. 520 nm에서 샘플, 블랭크 및 참조 표준물질의 흡광도를 판독합니다.
13. 참조 표준물질 및 샘플 판독값에서 빈 판독값을 뺍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
β-인산삼칼슘 디스크(β-TCP, 14mm)			디스크는 1150 °C의 온도에서 머플 용광로에서 소결 하였다. 샘플은 세포 배양에 사용하기 전에 UV 조사 (각 측면당 15 분)되었다
아리자린 레드 S	시그마-알드리치	A5533
뼈 성장 매체 (BGM)			α-MEM + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신
포르말린 용액 중성 완충 10%	시그마-알드리치	HT501128
헥사데실피르디늄(세틸피리디늄) 염화물 일수화물	시그마-알드리치	C9002
L-아스코르브산, 2-인산염, 세스키마그네슘, 소금, 수화물	시그마-알드리치	A8960
MEM 알파 매체(α-MEM)	Gibco Life 기술	11900-073
골형성 광물화 매체(MM)			α-MEM + 10% 열 불활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신 + 50μg/mL 아스코르브산 + 5mM β-글리세로포스페이
페니실린-스트렙토마이신	시그마-알드리치	P4333
인산염 완충 식염수 1x(PBS) pH 7.4	Gibco, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10010023
β-글리세로인산이나트륨 염 수화물	시그마-알드리치	G5422
초순수: 세포 배양수 발열원 무함유	폭스바겐	L0970-500
96웰 투명 플레이트	그라이너 바이오 원	655001
24웰 서스펜션 배양 플레이트	그라이너 바이오 원	662102
24웰 조직 배양 플레이트	그라이너 바이오 원	662160
원심분리기: VWR Mega Star 600R	폭스바겐
CO2 인큐베이터: HeraCell 240	써모 사이언티픽(Thermo Scientific
평판 스캐너 : Epson Perfection 1200 Photo	엡손
Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더	테칸
마이크로 원심분리기 튜브: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL	폭스바겐	21008-959
쉐이킹 인큐베이터 GFL3032	단골 섬유(GFL)	3032
일회용 피펫: 세럼 피펫	그라이너 바이오 원	612301