초기 단계 혈관 형성 평가를 위한 비드 발아 분석: 주피세포가 있는 곳에서 발아하는 내피를 연구하기 위한 체외 비드 기반 모델

초록

출처: Azam, S. H. et al. Encorporing Pericytes into a Endothelial Cell Bead Sprouting Assay(내피 세포 비드 발아 분석에 pericytes 통합). J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 혈관신생 초기 단계에서 내피 발아를 연구하기 위해 주피세포를 통합한 변형된 마이크로캐리어 비드 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 혈관 신생의 분자 메커니즘과 항 혈관 유전 치료의 효과를 이해하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

프로토콜

1. 젤 주입을 위한 비즈 준비

1. HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)와 주피세포(pericyte)로 코팅된 마이크로캐리어 비드를 포함하는 배양액을 예로 들어 보겠습니다.
2. 20X 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 마이크로캐리어 코팅된 비드가 들어 있는 접시를 검사하여 모든 비드가 내피 세포로 충분히 코팅되었는지 확인합니다.
3. 도금된 세포 용액을 세게 피펫으로 주입하여 6cm 플레이트에서 세포를 분리하고 용액을 튜브에 넣습니다. 완전한 매체로 플레이트를 2회 더 세척하고 튜브로 옮겨 플레이트에 부착될 수 있는 모든 잔류 비드를 수집합니다.
   1. 기포가 발생하지 않도록 하고 p1000 피펫을 사용하여 내피 세포 코팅 비드에 대한 전단 응력을 최소화합니다.
4. 용액의 비드가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 3분 동안 기다립니다.
5. p1000 피펫 팁을 사용하여 비드 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다(진공 흡입기를 사용하지 마십시오).
6. 각 튜브에 1mL의 완전한 배지를 추가하고 비드를 재현탁합니다.
7. 구슬이 바닥에 가라앉을 때까지 30-60초 동안 기다립니다. 그런 다음 비드 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다. 실수로 비드 펠릿을 제거할 가능성이 크게 높아지므로 진공 흡입기를 사용하지 마십시오.
8. 1.6단계와 1.7단계를 두 번 더 반복합니다. 목표는 6cm 플레이트에서 분리되었을 수 있는 자유 부유 HUVEC을 가능한 한 많이 제거하면서, 자유 부유 세포보다 바닥이 둥근 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 튜브에 더 빨리 침전되어야 하는 HUVEC 코팅 비드를 너무 많이 제거하지 않는 것입니다.
9. 비드에 1mL의 완전한 배지를 추가합니다.

2. 피브린 겔에 코팅된 비드 삽입

1. P1000 피펫을 사용하여 각 FACS 튜브의 비드 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 매체를 제거합니다.
2. 2.5mL의 피브리노겐 용액에 비드를 재현탁합니다.
3. 13μL의 트롬빈 용액을 24웰 유리 바닥 플레이트의 원하는 각 웰에 피펫팅합니다. 바닥이 유리로 된 판에 도금하는 것은 새싹을 최적으로 이미징하는 데 필수적입니다.
   참고: 다음 단계 전에 트롬빈을 5-10분 이상 우물에 방치하지 마십시오.
4. 각 웰에 0.5mL의 비드/피브리노겐 용액을 추가합니다.
   1. 매번 용액을 피펫팅하기 전에 비드 용액을 잘 재현탁하십시오.
   2. 웰에 이미 존재하는 트롬빈에 직접 조심스럽게 피펫팅하도록 주의하십시오. 용액을 위아래로 2-3회 천천히 피펫팅하여 용액을 완전히 혼합하고 기포가 유입되지 않도록 주의합니다.
   3. 웰 사이의 피펫 팁을 교체해야 합니다.
   4. 초기 피브린 응고 중 어느 시점에서도 플레이트를 움직이거나 방해하지 않도록 주의해야 하며, 이러한 움직임은 겔 형성을 방해할 수 있습니다.
5. 접시를 실온에서 30분 동안 후드에 그대로 두십시오.
6. 겔이 완전히 응고될 수 있도록 플레이트를 37°C 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 1.5-2시간 더
기다립니다.

3. 섬유아세포를 섬유아세포 겔 위에 도금

1. 겔이 응고되는 마지막 30분 동안 다음과 같이 Normal Human Lung Fibroblasts(NHLF)를 분리합니다.
   1. T175 플라스크의 세포를 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음 5mL의 세포 분리 용액을 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   2. 완전한 배지에서 20,000 cells/mL의 농도로 NHLF를 재현탁합니다.
      참고: NHLF 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)으로 배양할 수 있습니다.
2. NHLF 세포 현탁액 1mL를 각 웰의 겔에 플레이트로 만들고 다시 인큐베이터에 넣습니다.
3. 분석 기간 동안 격일로 전체 배지를 교체하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
멸균 피펫 팁	폭스바겐
피펫터	에펜도르프
완전한 EGM2 미디어 불릿 키트	론자	CC-3162	HUVEC 미디어
MEM (멤)	지브코	11095114	10T1/2 미디어
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11965118	NHLF 미디어
조직 배양 등급 PBS	지브코	14190-144	마그네슘 및 칼슘 무함유
아카쿠타아제	생명 기술	A1110501	HUVEC 리프팅용
트립신	생명 기술	15050065	10T 1/2 및 NHLF 리프팅용
후벡	론자	C2517A는
10톤 1/2	증권 시세
NHLF	증권 시세
Cytodex 3 마이크로캐리어 비드	시그마	C3275 (영문
조직 배양으로 코팅된 6cm 및 10cm 플레이트	코 닝
소 혈장에서 추출한 피브리노겐	시그마	F8630
트롬빈	시그마	T9549
아프로티닌	시그마	A3428
Falcon 라운드 바텀 튜브	코 닝
조직 배양 인큐베이터 및 후드
24웰 유리 바닥판	매트텍	P24G1.513F	유리 바닥 판은 콩나물을 이미지화하려는 경우에만 필요합니다. 그렇지 않은 경우 조직 배양 플라스틱도 사용할 수 있습니다.

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