이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
1.4K 조회수
⸱
2025년 7월 8일
출처: Brito-Sierra, C. A., et al. 모기에 대한 새로운 살충 화학 물질의 독성 테스트를 위한 프로토콜 J. Vis. Exp. (2019)
이 비디오에서는 여러 인간 전염병의 매개체로 알려진 모기의 세 번째 instar 단계 유충에서 도파민 수용체 길항제 amitriptyline의 독성을 평가하기 위한 유충 접촉 분석에 대해 설명합니다. 서로 다른 시간 간격에 걸쳐 서로 다른 아미트라이프틸린 농도로 부화 시 유충의 폐사율을 평가하면 치사 농도를 결정하는 데 도움이 된다 50.
1. 유충 접촉 분석 (단일 포인트 용량 또는 용량 응답 분석)
참고: 테스트 웰에서 DMSO의 최종 농도가 1%를 초과하지 않는 한 물 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해되는 화학 물질로 분석을 수행할 수 있습니다. 대체 용매를 선택할 수 있지만, 먼저 최종 농도가 노출 후 72시간에 10% 이상의 폐사를 유발하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 분석은 단일 포인트 용량 또는 용량-반응 분석으로 수행될 수 있습니다. 후자를 수행하는 경우 예상 LC50에 걸쳐 농도 범위(최소 5개)를 테스트하는 것이 좋습니다.
표 1. Aedes aegypti L3 유충 (A) 단일 포인트 용량 분석 및 (B) 용량-반응 분석에 대한 계산 예시.
| A. 3개의 화학 물질을 사용한 단일 포인트 용량 분석 | |||||
| 화학 | 농도(400uM) | ||||
| 아미트립틸린 | 80 mM 재고: 아미트라이프틸린 2mg X 98%(분말 순도) X 0.001g/1mg X 1mol /313.86g X 1L/0.08mol X 106μL/L = 물 78.06μL. | ||||
| Serial Dilutions: ddH2O로 스톡을 1:2로 희석한 다음 1:4로 희석하여 10mM을 얻습니다. 960μL의 ddH20이 포함된 웰에 10mM 스톡 40μL를 추가하여 최종 농도 400μM/웰을 달성합니다. 5mM, 2.5mM, 1.25mM 및 0.625mM 스톡을 얻기 위해 10mM 스톡의 연속 희석을 1:2로 준비합니다. | |||||
| Cis-(z)-플루펜텁솔 | 80 mM 재고: 2 mg의 cis(z)flupenthixol X 98%(분말의 순도) X 0.001 g/1 mg X 1 mol/507.44 g cis(z)flupenthixol X 1L/0.08 mol X 106 μL/L = 48.28 μL의 물. | ||||
| 직렬 희석: 위와 같이. | |||||
| 아미트라즈 | 80 mM 재고: Amitraz 2 mg X 0.001 g/1 mg X 1 mol/293.4 g amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 μL/1 L = 85.21 μL DMSO (참고: Amitraz는 DMSO에만 용해됨). | ||||
| 직렬 희석: 위와 같이. | |||||
| B. 용량-반응 분석 | |||||
| 케미스 | 용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 |
| 400 마이크로미터 | 200 마이크로미터 | 100 마이크로미터 | 50 마이크로미터 | 25 μM | |
| 예: Amitriptyline, cis-(Z)-flupenthixol oramitraz | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL |
| 10mM 스톡 | 5mM 재고 | 2.5mM 스톡 | 1.25mM 스톡 | 0.625mM 재고 | |
표 2. 모기 유충 용량-반응 분석의 데이터를 기록하는 데 사용되는 예시 점수 시트. 제어, 물만 또는 1% DMSO 또는 기타 용매만 있는 물. 아미트리프트릴린과 같은 저분자 길항제 화학 물질을 테스트하는 데 사용되는 일반적인 용량은 25μM, 50μM, 100μM, 200μM 및 400μM입니다.
개 개 호 세 분 분 의 개 개 호 세 분 분 의| 모기 L3 애벌레 분석 | ||||||
| 시작 날짜: | ||||||
| 수사관: | ||||||
| 종/균주: | ||||||
| 분석 유형: 단일 포인트 용량/용량 응답 | ||||||
| ||||||
| 시간(시간) | 용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 | 제어 |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| 3 | ||||||
| 12 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| ||||||
| 시간(시간) | 용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 | 제어 |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| 3 | ||||||
| 12 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 살충제에 취약한 모기 균주 | Malaria Research and Reagent Reference Repository(말라리아 연구 및 시약 참조 저장소) | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; 권장 균주 : Aedes aegypti 리버풀 (LVP) 균주, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) 균주 및 Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) 균주 | |
| 아세톤 | Mallinckrodt 화학 | CAS 67-64-1 | 희석 및 제어에 사용 |
| 아미트라즈 | 시그마-알드리치 | CAS 33089-61-1 | DMSO에서 희석 필요 |
| 아미트라이프틸린 | 시그마-알드리치 | CAS : 549-18-8 | 아세톤으로 희석할 수 있습니다. |
| 시스-(Z)-플루펜틱솔 | 시그마-알드리치 | CAS : 51529-01-2 | dop-like receptor의 교란 물질로 약리학적으로 테스트됨 |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | 시그마-알드리치 | MKBF2985 | amitraz를 용해시키는 데 사용되는 유기 용매 |
| 뚜껑이 있는 24웰 세포 배양 플레이트 | 코닝 주식회사 | 3526 | |
| 파이펫 이송 | 피셔 사이언티픽 | 13-711-7엠 | 유충을 분류하는 데 사용됩니다. |
| 실체 현미경 | 올림푸스 | SZ6045 | 유충 분석에 점수를 매기고 마이크로 응용 프로그램을 수행하는 데 사용됩니다. |
