국소 검사 분석: 국소 적용으로 성인 암컷 모기에 대한 도파민 수용체 길항제의 살충 가능성을 평가하는 기술

초록

출처: Brito-Sierra, C.A. et al., 모기에 대한 새로운 살충 화학 물질의 독성을 테스트하기 위한 프로토콜. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오에서는 성인 암컷 모기에 대한 잠재적 살충제의 독성을 결정하기 위한 국소 테스트 분석을 시연합니다. 모기의 신경 전달을 치명적으로 억제하는 도파민 수용체 길항제를 사용하는 이 방법은 국소 살포 시 살충제의 독성 효과를 평가하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 모기 성인의 문화

참고: 살충제에 취약한 모기 균주는 Malaria Research and Reagent Reference Repository에서 구할 수 있습니다. 권장되는 균주는 Aedes aegypti Liverpool(LVP) 균주, Anopheles gambiae Kisumu(KISUMU1) 균주 및 Culex quinquefasciatus Johannesburg(JHB) 균주입니다.

1. Nuss가 설명한 대로 25cm x 40cm 플라스틱 트레이(트레이당 ~ 400마리)에서 28°C 및 75-85% 상대 습도(RH)에서 12시간 낮/12시간 밤 주기로 알에서 모기 유충을 배양합니다. 유충에게 갈은 저빌(A. aegypti 및 An. gambiae) 또는 플레이크 물고기 먹이(C. quinquefasciatus)를 먹이십시오. 유충 분석의 경우 세 번째 유충(L3) instar 단계에서 유충을 수집합니다.
2. 번데기에서 성충 모기를 플라스틱 컵으로 옮겨 위에서 설명한 조건에서 곤충의 20L 플라스틱 케이지 안에 넣습니다. 다른 곳에서 설명한 대로 20% 설탕 용액에 모기를 유지하십시오. 출현 후 3-5일에 성충을 모으십시오.

2. 성인 국소 분석(단일 포인트 용량 또는 용량 응답 분석)

참고: 성인 국소 분석은 아세톤을 용매로 사용하여 수행됩니다. 대체 용매를 사용할 수도 있지만, 먼저 최종 농도가 노출 후 48시간 시점에 10% 이상의 폐사율을 유발하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 분석은 단일 포인트 용량 또는 용량 반응 분석으로 수행될 수 있으며 치사량(LD)을 결정하는 데 사용됩니다. 후자를 수행하는 경우 예상 LD₅₀에 걸쳐 농도 범위(최소 5개)를 테스트하는 것이 좋습니다.

1. 분석을 완료하는 데 필요한 성체 암컷 모기의 수를 결정합니다.
   메모: 단일 화학 물질을 사용한 점 선량 분석에는 최소 90마리의 모기가 필요합니다(양성 대조군의 경우 30마리, 아세톤 단독 음성 대조군의 경우 30마리, 테스트 화학의 경우 30마리).
2. 생후 3일에서 5일 된 성체 암컷 모기를 배양하고 흡입기를 사용하여 별도의 20mL 플라스틱 통으로 이동합니다(그림 1).
3. 9oz 종이컵에 테스트 화학 물질의 이름과 농도를 표시합니다. 각 컵에 대해 10cm x 10cm 메쉬 사각형과 고무 밴드를 따로 보관하십시오(그림 2 참조).
4. 기존 살충제를 양성 대조군으로 선택하고 (예: 합성 피레스로이드, 비펜트린) 아세톤에 1% 원액(10μg/μL)을 준비합니다.
   참고: 계산은 화학 물질의 순도를 고려해야 합니다. 예를 들어, 순도가 99%인 화학 물질의 경우 10.1mg을 1,000μL의 아세톤에 용해시켜 1% 용액을 얻습니다. 파라핀 필름으로 밀봉하고 -20 °C에서 보관하십시오.
5. 위와 동일한 절차를 사용하여 테스트 chemistry.
   의 원액을 준비합니다. 메모: 많은 테스트 화학 물질은 매우 불안정하며, 생물학적 분석이 수행될 때마다 용액을 새로 만드는 것이 좋습니다.
6. 그림 3과 같이 이전에 아세톤으로 헹궈낸 20mL 유리 바이알을 사용하여 원액에서 양성 대조군의 연속 희석을 준비하고 화학 물질을 테스트합니다.
7. 1mL 유리 주사기에 아세톤을 퍼지하고 아세톤을 채운 다음 0.25μL의 부피를 전달하도록 조정된 마이크로 애플리케이터에 고정합니다.
8. 10 명씩 배치하여 흡인기기를 사용하여 3-5 일 된 성인 암컷 모기를 우리에서 제거하고 냉장고 또는 얼음에서 4 ° C에서 최대 5 분 동안 마취합니다. 다음으로, 모기를 페트리 접시에 옮기고 최대 10분 동안 얼음 위에 놓습니다.
9. 신속하게 작업하여 미세한 핀셋으로 암컷 한 명을 제거하고 주사기 마이크로 어플리케이터를 사용하여 등쪽 흉부에 0.25μL의 테스트 용액을 도포합니다. 각 모기가 적절한 양의 테스트 화학 물질을 받는지 확인하기 위해 해부 현미경을 사용하여 관찰을 통해 화학 물질의 전달을 확인합니다.
10. 얼음 위에 놓인 라벨이 붙은 종이컵에 모기를 옮기고 9회 반복하여 n = 10개의 처리된 모기를 얻습니다. 고무 밴드로 고정 된 메쉬 사각형으로 컵의 모기를 밀봉하고 28 ° C 및 75-85 % RH의 일정한 조건에서 플라스틱 욕조 또는 성장 챔버로 옮깁니다 (12 시간 주간 / 12 시간 밤 주기가 바람직함).
11. 위의 실험을 두 번 반복하여 처리 그룹 또는 대조군당 n = 3개의 기술적 복제(즉, 총 30마리의 모기)를 얻습니다.
12. 먼저 테스트 화학에 대해 2.7-2.10단계를 반복한 다음 positive control.
    에 대해 반복합니다. 메모: 충분한 모기를 사용할 수 있는 경우 포함할 수 있는 또 다른 유용한 대조군은 테스트 화학 물질이나 용매를 투여받지 않는 30마리의 마취된 모기의 "공백"입니다.
13. 점수 시트를 사용하여 노출 후 30분, 60분, 2시간, 24시간 및 48시간(또는 대체 시점)에 "죽은/무반응" 모기의 수를 기록합니다(표 1). 모기가 움직임이 부족한 경우 모기를 "죽은/무반응"으로 평가하며, 한쪽 또는 뒤쪽으로 누워 있고 날 수 없는 것으로 정의됩니다.
14. 원하는 경우 다음과 같이 수정된 Abbott의 공식을 사용하여 대조 사망률을 수정합니다.
    사망률(%) = (X-Y) *100/(100-Y),
    여기서 X = 처리된 표본의 사망률, Y = 대조군의 사망률.
15. 결과를 히스토그램 또는 지수 곡선으로 표시합니다. 용량-반응 분석의 경우, 대조군을 기준으로 테스트 화학에 대한 LD₅₀, LD₇₅ 또는 LD₉₀ 값을 계산합니다.
16. n = 3 이상의 생물학적 복제물을 얻기 위해 별도의 모기 배치를 사용하여 분석을 최소 두 번 반복합니다.

결과

그림 1: 성충 모기의 배양. 성체 모기의 배양에 사용되는 20L 플라스틱 양동이와 모기를 제거하기 위한 흡인기 사용을 보여주는 이미지.

그림 2. 생후 4-5일 된 암컷 Aedes aegypti를 사용하여 수행한 성인 국소 분석. 화학 물질 또는 용매로 처리한 후 성충 모기를 종이컵에 넣고 분석 기간 동안 테스트 챔버로 옮깁니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
살충제에 취약한 모기 균주	Malaria Research and Reagent Reference Repository(말라리아 연구 및 시약 참조 저장소)	https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; 권장 균주: Aedes aegypti Liverpool(LVP) 균주, Anopheles gambiae Kisumu(KISUMU1) 균주 및 Culex quinquefasciatus Johannesburg(JHB) 균주
아세톤	Mallinckrodt 화학	CAS 67-64-1	희석 및 제어에 사용
아미트라이프틸린	시그마-알드리치	CAS : 549-18-8	아세톤으로 희석할 수 있습니다.
비펜트린	시그마-알드리치	CAS : 51529-01-2	양성 대조군으로 사용되는 합성 피레토리드
마이크로 애플리케이터	Burkard 제조 회사	-	국소 응용 실험에 필요한 도구
뚜껑이 있는 24웰 세포 배양 플레이트	코닝 주식회사	3526	-
장점 고무 밴드	얼라이언스 고무 (주)	-	종이컵을 밀봉하는 데 사용됩니다.
유리 주사기(1ml)	Becton 디킨슨 앤 컴퍼니	512004	마이크로 애플리케이션에 필요합니다. 유리는 플라스틱보다 낫습니다.
일회용 섬광 바이알 (20ml)	피셔 사이언티픽	74505-20	유리 바이알은 증발을 방지합니다.
튤 패브릭, 화이트	월마트	-	-
종이컵	딕시 소비자 제품 LLC.	PF15675/13D	성체 국소 분석에서 성체 모기를 유지하는 데 사용됩니다
페트리 접시 (150mm)	코닝 생명과학	-	얼음과 직접 접촉하지 않고 추위에서 "잤다"는 모기를 유지하는 데 사용됩니다.
파이펫 이송	피셔 사이언티픽	13-711-7엠	유충을 분류하는 데 사용됩니다.
실체 현미경	올림푸스	SZ6045	유충 분석에 점수를 매기고 마이크로 응용 프로그램을 수행하는 데 사용됩니다.
핀셋 (파인)	폰탁스	-	성인 모기를 다루는 데 사용됩니다.