모기 먹이 분석: 성체 암컷 모기의 폐사율 및 생식력에 대한 테스트 복합 효과를 평가하는 방법

초록

출처: Brito-Sierra, C. A. et al., 모기에 대한 새로운 살충 화학 물질의 독성 테스트를 위한 프로토콜. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 암컷 모기에 대한 새로운 작용 모드를 가진 테스트 화합물의 폐사율과 번식력을 평가하기 위한 혈액 공급 분석을 보여줍니다. 이 기술은 새로운 종류의 살충제를 스크리닝하여 모기의 저항성 개체군을 죽이고 질병 확산을 통제하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 성인 혈액 공급 분석(단일 포인트 용량 또는 용량 반응 분석)

1. 약 150 마리의 4-5 일 된 성인 암컷 모기를 수집하여 별도의 케이지로 옮깁니다. 용량-반응 분석을 수행하는 경우 6개의 케이지를 얻기 위해 반복합니다. 먹이 분석 1-24시간 전에 설탕 공급원을 제거하십시오.
2. 위에서 설명한 바와 같이 화학 물질의 순도를 고려하여 화학 물질의 원액을 준비하고(일반적인 원액은 물 또는 염 완충액에 80mM임), 이후에 필요에 따라 물/완충액에 연속 희석액을 준비합니다.
3. 제분된 토끼 혈액 960μL에 각 희석액 40μL를 첨가하여 원하는 검사 농도를 얻습니다. 공급 장치에 멤브레인 필름을 바르고 고무 링으로 밀봉합니다. 피펫을 통해 혈액 1mL를 옮기고 공급 장치를 가열 장치에 부착합니다.
4. 갓 만든 10% 젖산 용액으로 멤브레인 표면을 부드럽게 닦고 먹이 장치를 성충 모기의 우리에 넣습니다. 어두운 천이나 검은색 쓰레기 봉투로 케이지를 덮고 모기가 한 시간 동안 먹이를 먹도록 합니다.
5. 나머지 테스트 용액과 음성(혈액 전용) 대조군에 대해 1.2-1.4단계를 반복합니다.
6. 먹이가 끝나면 양동이를 4°C의 냉장고에 5분 동안 넣어 모기를 마취합니다. 수컷 모기와 먹이를 먹지 않은 암컷 모기를 제거하고, 복부를 검사하여 먹이를 먹은 모기와 부분적으로 먹이를 먹은 모기의 총 수를 세고 기록합니다.
7. 부분적으로 먹이를 먹은 암컷 모기를 유지하고, 복용량당 최소 50마리의 혈액을 먹인 모기를 목표로 합니다.
8. 28 °C 및 75 - 85% RH의 일정한 조건에서 버킷을 플라스틱 통 또는 성장 챔버로 옮깁니다(12시간 낮/12시간 밤 주기가 바람직함).
9. 점수 시트를 사용하여 0.5, 1, 1.5, 2, 24, 48 및 72시간(또는 원하는 대체 시점)에 죽은/무반응 모기의 총 수를 기록합니다(표 1).
10. 혈액 공급 후 3일째에는 계란 컵을 케이지에 넣고 72시간 동안 계란을 수집합니다. 해부 현미경으로 처리당 생산된 난자의 총 수를 세십시오.
11. 폐사율과 번식률을 각 치료 그룹과 대조군에 대한 먹이를 먹은 모기의 총 수에 대한 함수로 계산합니다. 원하는 경우 수정된 Abbott의 공식을 사용하여 대조군 폐사율을 수정합니다.
12. 선택한 소프트웨어를 사용하여 독성 및 번식력 데이터를 히스토그램 플롯 또는 지수 곡선(용량-반응 분석을 수행하는 경우)으로 표시합니다. 용량-반응 분석을 수행하는 경우 대조군을 기준으로 테스트 화학에 대한 LD₅₀, LD₇₅ 또는 LD₉₀ 값을 계산합니다.
13. n = 3 이상의 생물학적 복제물을 얻기 위해 별도의 모기 배치를 사용하여 분석을 최소 두 번 반복합니다.

표 1. 성인 혈액 공급 분석의 데이터를 기록하는 데 사용되는 점수 시트의 예.아미트리프트틸린과 같은 저분자 길항제 화학 물질을 테스트하는 데 사용되는 일반적인 용량은 50μM, 100μM, 200μM 및 400μM입니다.

개 개 호 개 개 호

모기 성체(3-5일령) 국소 분석
시작 날짜:
수사관:
종/균주:
분석 유형: 단일 포인트 용량/용량 반응
A. 사망률 (죽은 모기 없음)
시간(시간)	용량 1	복용량 2	복용량 3	복용량 4	복용량 5	제어
0.5
1
1.5
2
2.5
B. 사망률
시간(시간)	용량 1	복용량 2	복용량 3	복용량 4	복용량 5	제어
0.5
1
1.5
2
2.5

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
살충제에 취약한 모기 균주	Malaria Research and Reagent Reference Repository(말라리아 연구 및 시약 참조 저장소)	https://www.beiresources.org/ MR4Home.aspx; 권장 균주: Aedes aegypti Liverpool(LVP) 균주, Anopheles gambiae Kisumu(KISUMU1) 균주 및 Culex quinquefasciatus Johannesburg(JHB) 균주
비펜트린	시그마-알드리치	CAS : 51529-01-2	양성 대조군으로 사용되는 합성 피레토리드
제세된 토끼 혈액	헤모스탯	DRB0100	인공 먹이에 적응 된 모기의 혈액 공급원
Hemotek 멤브레인 공급 시스템	헤모텍 주식회사	통권1303	모기의 먹이를 위해 사용하는
파이펫 이송	피셔 사이언티픽	13-711-7M U
실체 현미경	올림푸스	SZ6045	유충 분석에 점수를 매기고 마이크로 응용 프로그램을 수행하는 데 사용됩니다.
핀셋 (파인)	폰탁스		성인 모기를 다루는 데 사용됩니다.
종이컵	딕시 소비자 제품 LLC.	PF15675/13D	성체 국소 분석에서 성체 모기를 유지하는 데 사용됩니다
장점 고무 밴드	얼라이언스 고무 (주)		종이컵을 밀봉하는 데 사용됩니다.