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1. 렌티바이러스 생산
참고: 렌티바이러스 벡터의 생산 및 조작은 재조합 DNA와 관련된 연구에 대한 NIH(National Institutes of Health) 지침에 따라 수행되었습니다. 향상된 YFP(SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V-YFP)로 태그된 야생형 및 A4V 돌연변이 SOD1을 인코딩하는 플라스미드가 사용됩니다. 두 유전자 융합 산물을 PCR 프라이머 쌍 5'-ATCGTCTAGACACCATGGCGACAGGTCGTGTGC-3' 및 5'-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'를 사용하여 증폭하고 XhoI 및 BsrGI 제한 부위를 사용하여 pTRIP-delta U3 CMV 플라스미드에 삽입했습니다. 20개 이상의 계대를 피하고 60% 미만의 포화도에서 세포를 유지하면 우수한 transfection 효율을 보장하는 데 도움이 됩니다.
- 1일차에 바이러스 생산을 위해 10mL의 세포 배양 배지(10% FBS 및 4mM L-글루타민이 있는 고포도당 DMEM)에서 10cm 직경의 조직 배양 플레이트(3 x 10⁶ 세포/접시)에서 HEK-293T 세포를 30 - 40% 합류로 분할합니다.
- 직경 10cm의 조직 배양 플레이트를 CO₂ 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 하룻밤 동안 보관합니다.
- 2일차에 10μg의 렌티바이러스 벡터(pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP 또는 -SOD1A4V-YFP)와 렌티바이러스 패키징 플라스미드(5μg pVSVg, 10μg pCMV-dR8.71)를 함유한 DNA transfection 용액을 준비합니다(그림 1A). 125μL의 1M CaCl₂를 추가하고 증류수를 사용하여 부피를 500μL로 조정합니다. 혼합물에 0.05 M HEPES의 500 μL를 부드럽게 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양합니다.
- HEK-293T 세포 배지를 1mL DNA 트랜스펙션 용액과 혼합된 10mL 예열 신선 배양 배지(항생제가 없는 10mL)로 교체하고 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 3일차에는 세포 상등액을 새로운 배양 배지로 교체합니다.
- 4일차에 15mL 튜브에서 상층액을 채취하고 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 죽은 세포와 파편을 제거합니다. 또한 대형 60mL 주사기를 사용하여 0.45μm 필터에 상등액을 통과시켜 상층액을 더욱 정제합니다. 일회용 부분 표본(300 μL)에 즉시 분주하고 -80 °C에서 보관합니다. 최대 제품 활성을 유지하려면 동결-해동 주기를 피하십시오.
2. 렌티바이러스 형질도입
- 10% FBS가 보충된 2mL의 DMEM 배지에 있는 6웰 조직 배양 플레이트에서 60% confluence(HEK-293 세포 및 SH-SY5Y; 웰당 5 x 10⁵ 세포 및 U2OS; 웰당 1 x 10⁵ 세포)로 감염될 세포주를 분할합니다.
- 6웰 조직 배양 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 5% CO₂로 하룻밤 동안 보관합니다.
- -80 °C 냉동고에서 얼린 렌티바이러스를 꺼내고 매번 사용하기 전에 얼음에서 부분 표본을 해동하십시오. 다시 얼리지 마십시오.
- 바이러스가 해동되는 동안 관심 세포주와 호환되는 혈청이 포함된 세포 배양 배지를 가열합니다. 바이러스가 완전히 해동되면 새로운 1.5mL 마이크로분리 튜브에 DMEM에서 다양한 희석액(1:3, 1:10, 1:30 및 1:100)을 준비합니다.
- 혈청 배지를 줄여 튜브의 부피를 1mL로 높입니다.
- 2 μL의 폴리브레네(4 μg/μL 재고에서)를 1 mL의 바이러스/배지에 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞고 혼합물 1mL를 세포에 첨가합니다. 24시간 동안 바이러스와 함께 세포를 배양합니다.
- 바이러스 매체를 제거하고 10% FBS가 보충된 일반 DMEM 매체로 교체합니다. 셀을 37°C, 5% CO₂로 유지합니다.
- 세포의 성장을 모니터링하고 이틀에 한 번씩 배양 배지를 교체하십시오. 합류 지점에서 6웰 접시를 직경 10cm의 조직 배양 플레이트로 확장합니다.
- 세포가 충분히 확장되면 384웰 분석 플레이트에서 50μL의 DMEM 배지에 웰당 1.5 x 10⁴ 세포를 시딩하여 현미경으로 YFP 태그 단백질의 발현 수준을 확인합니다. YFP 태그가 지정된 단백질 세포 발현이 신호 대 잡음비 ≥3을 나타내는 경우 해당 세포주에 대한 세포 스톡을 준비합니다.
3. 단백질 응집에 대한 프로테아좀 억제제의 시간 의존적 효과
참고: 자동 현미경을 사용하여 이미지 획득을 수행합니다(재료 참조).
- 100% DMSO(ALLN, 2mM)에 용해된 0.25μL의 DMSO 또는 프로테아좀 억제제를 384웰 평면 바닥 플레이트에 디스펜싱합니다.
- 동일한 분석 플레이트에서 50μL의 DMEM 배지에 웰당 1.5 x 104개의 세포를 수동으로 시딩합니다. 프로테아좀 억제제(ALLN) 최종 농도는 10μM이어야 합니다.
- 현미경 시스템 환경 제어 장치를 37°C 및 5% CO₂로 설정합니다. 실험 설정의 스크린샷은 그림 2에 나와 있습니다.
- 다음 설정의 소프트웨어를 사용하여 광시야 형광 모드에서 현미경을 작동합니다: LWD 20X 대물렌즈, 비공초점 모드, 4개 필드/웰, 캡처 간격 1시간. 각 실행이 끝나면 캡처된 이미지가 자동으로 서버에 업로드됩니다.
4. 살아있는 세포에서 YFP 발현을 위한 타임랩스 이미징 및 이미지 분석(단일 채널)
참고: 다음 단계는 소프트웨어(예: Columbus)의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
- 기본 개체(cytosol 및 aggregates)를 분할할 적절한 알고리즘을 선택합니다. 필요한 경우 배경 임계값 및 대비 매개변수를 조정합니다(그림 3).
- YFP intensity channel에 대한 개별 임계값이 0.1인 'find cells'를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 상대 YFP 스폿 강도가 >0.2이고 분할 계수가 1.0인 'spot 찾기' 알고리즘을 사용하여 집계를 결정합니다.
5. 핵(2개 채널)에 대해 염색된 살아있는 세포의 단백질 응집에 대한 프로테아솜 억제제의 용량 반응 효과
참고: 자동 현미경을 사용하여 이미지 획득을 수행합니다. 최적의 곡선 맞춤을 보장하기 위해 예상 IC50 값을 기반으로 프로테아좀 억제제(ALLN, Epoxomicin 및 MG132)의 농도 범위를 결정합니다.
- 표준 1:3 희석 시리즈로 384웰 저장 폴리프로필렌 플레이트에서 화합물의 연속 희석을 준비합니다. 화합물 농도가 정확한지 확인하기 위해 화합물 희석액을 잘 혼합하십시오.
- 0.25μL의 프로테아솜 억제제를 빈 평평한 바닥 검은색 384웰 분석 플레이트에 분배합니다. 우리는 부피를 전달할 수 있는 384개의 모세관 헤드가 장착된 액체 처리기를 사용합니다.
- 분석 플레이트에서 50μL의 DMEM 배지에 웰당 1.5 x 1010⁴ 세포를 시딩합니다. 분석 플레이트를 37°C 및 5% CO₂에서 24시간 동안 배양합니다.
- 10μL의 DMEM 배지(37°C에서 예열)를 염색 용액(10mg/mL 재고에서 Hoechst 33342)과 함께 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 현미경 운영 소프트웨어를 실행합니다. 실험 설정의 스크린샷은 그림 4에 나와 있습니다. "구성" 탭을 선택하고 20X 대물렌즈와 올바른 플레이트 유형을 선택합니다. 대물렌즈에서 "collar"가 올바른 값으로 설정되어 있는지 확인하여 다양한 플레이트 유형에서 적절한 초점을 맞출 수 있도록 합니다.
- "현미경" 탭을 선택합니다. 노출 1을 YFP(488 레이저)로 정의하고 노출 2를 Hoechst(405 레이저)로 정의합니다. 두 노출에서 필터를 활성화하고 카메라 1에 노출 1을 할당하고 카메라 2에 노출 2를 할당합니다. 노출 시간을 노출 1의 경우 ~800ms, 노출 2의 경우 ~40ms로 설정합니다.
- 노출 1을 선택합니다. 초점 높이를 0μm로 설정합니다. "초점"을 선택합니다. 초점이 맞춰지면 카메라 1을 노출시킵니다. 초점 높이를 조정하여 노출 평면을 최적화하고 "Take height"를 클릭합니다. 노출 시간과 레이저 파워를 변경하여 ~3,000의 최대 픽셀 강도를 제공합니다. 노출 매개변수를 저장합니다. 노출 2에 대해 반복합니다.
- "Experiment Definition" 탭을 선택합니다. 레이아웃 및 하위 레이아웃을 만듭니다. 관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, skewcrop 파일 및 하위 레이아웃을 끌어다 놓습니다. 실험을 저장합니다.
- "Automatic Experiment" 탭을 선택하고 이미지를 획득합니다. 각 실행이 끝나면 캡처된 이미지가 자동으로 서버에 업로드됩니다.
6. 2채널 이미지의 이미지 분석
- 1차 개체(핵, 세포질 및 응집체)를 분할할 소프트웨어 알고리즘을 선택합니다(그림 5).
- 분할된 물체의 육안 검사를 통해 핵을 정확하게 분할하는 방법을 선택합니다. 채널 1(Ch1)의 Hoechst 염색 물체는 세포 수를 결정하는 데 사용됩니다. 채널 2(Ch2)의 돌연변이 SOD1-A4V의 YFP 염색은 응집체의 양을 결정하는 데 사용됩니다.
- '핵 찾기' 알고리즘을 사용하여 Hoechst 염색 영역>20μm², 분할 계수 7.0, 개별 임계값 0.40, 대비 >0.10으로 세포 수를 계산합니다.
- 데이터 테이블을 만들고 그래프 작성 소프트웨어에서 'Non-linear regression' 방정식을 사용하여 각 화합물에 대한 EC50을 계산합니다.
