Protein Aggregate Formation Assay: 프로테아솜 억제제에 의한 유도 시 배양된 세포에서 단백질 응집을 검출하고 정량화하는 방법

초록

출처: Lee, H. et al. 살아있는 세포에서 Sod1 돌연변이 단백질 응집체 형성의 고함량 정량화를 위한 분석 개발. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오에서는 프로테아좀 억제제를 사용하여 프로테아좀 활성을 차단하여 형광 표지에 융합된 잘못 접힌 돌연변이 단백질이 유비퀴틴 의존성 프로테아솜 분해를 겪어 세포 세포질 내에 축적되는 것을 방지하는 세포 기반 단백질 응집 분석을 시연합니다. 그런 다음 단백질 응집체를 시각화하고 형광 현미경으로 정량화합니다.

프로토콜

1. 렌티바이러스 생산

참고: 렌티바이러스 벡터의 생산 및 조작은 재조합 DNA와 관련된 연구에 대한 NIH(National Institutes of Health) 지침에 따라 수행되었습니다. 향상된 YFP(SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V-YFP)로 태그된 야생형 및 A4V 돌연변이 SOD1을 인코딩하는 플라스미드가 사용됩니다. 두 유전자 융합 산물을 PCR 프라이머 쌍 5'-ATCGTCTAGACACCATGGCGACAGGTCGTGTGC-3' 및 5'-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'를 사용하여 증폭하고 XhoI 및 BsrGI 제한 부위를 사용하여 pTRIP-delta U3 CMV 플라스미드에 삽입했습니다. 20개 이상의 계대를 피하고 60% 미만의 포화도에서 세포를 유지하면 우수한 transfection 효율을 보장하는 데 도움이 됩니다.

1. 1일차에 바이러스 생산을 위해 10mL의 세포 배양 배지(10% FBS 및 4mM L-글루타민이 있는 고포도당 DMEM)에서 10cm 직경의 조직 배양 플레이트(3 x 10⁶ 세포/접시)에서 HEK-293T 세포를 30 - 40% 합류로 분할합니다.
2. 직경 10cm의 조직 배양 플레이트를 CO₂ 인큐베....

결과

그림 1. SOD1 WT 및 A4V 안정적인 라인 생성. (A) 야생형 및 돌연변이 SOD1 A4V 렌티바이러스 생성을 위한 렌티바이러스 및 패키징 벡터(패킹 및 엔벨롭 플라스미드)의 개략도. (B) 렌티바이러스 야생형 SOD1(WT) 및 돌연변이 SOD1(A4V)로 형질주입된 3개 세포(HEK-293, U2OS 및 SH-SY5Y)의 선별된 컨포칼 이미지. (C) 프로테아좀 억제제인 ALLN(10μM)으로 24시간 동안 처리된 3개의 안정한 세포의 대표 이미지. SOD1A4V-YFP 응집체는 HEK-293에 풍부하게 존재하지만(빨간색 화살표) U2OS 또는 SH-SY5Y 세포에는 드물게 존재하는 것으로 밝혀졌습니다. 이미지는 20X 대물렌즈를 사용하여 획득했습.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ALLN (C20H37N3O4)	밀리포어	208719
MG132 (C26H41N3O5)	시그마-알드리치	C2211
에폭소마이신 (C28H50N4O7)	시그마-알드리치	E3652
회스트: 33342	인비트로젠	H-3570
오페라	퍼킨 엘머	OP-QEHS-01
Opera EvoShell 소프트웨어	퍼킨 엘머	버전 1.8.1
오페레타	퍼킨 엘머	OPRT1288
Harmony Imaging 소프트웨어	퍼킨 엘머	버전 3.0.0
콜럼버스 이미지 분석 소프트웨어	퍼킨 엘머	버전 2.3.2
CyBi Hummingwell 액체 취급	싸이바이오 AG	OL 3387 3 0110