내독소 활성 분석: 혈액 샘플의 내독소 활성을 조사하기 위한 화학발광 기반 생물학적 분석

초록

출처: Pinciroli, R. et al. 중증 환자에서 전혈 내독소혈증 검출을 위한 내독소 활성 분석. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 화학발광 기반 방법을 통해 전혈 샘플의 내독소 활성을 조사하기 위한 신속한 생물학적 분석을 보여줍니다. 이 분석법은 내독소 매개 패혈증의 조기 진단을 위한 빠르고 민감한 바이오마커 검사입니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 내독소 활성 분석(EAA)

1. EDTA 항응고제가 들어있는 멸균 튜브에서 환자의 혈액 샘플을 수집합니다. 혈액 샘플을 실온에서 보관하십시오
.
2. 검사해야 하는 각 환자의 혈액 샘플에 대해 EA 검사관을 준비합니다. 튜브를 튜브 랙에 넣습니다. 그런 다음 캡을 제거합니다.
3. 각 EA 테스트는 5가지 종류의 튜브로 구성됩니다. 테스트의 다른 부분에 각각 사용합니다(다음 단계 참조).
   1. 튜브 #1("대조군" 튜브)을 사용하여 특정 항체가 없는 경우 환자 호중구의 비특이적 산화 폭발의 기저 활성을 측정합니다.
   2. 튜브 #2("샘플" 튜브)를 사용하여 지질다당류(LPS)-항체 복합체에 대한 반응으로 발생하는 산화 버스트를 측정합니다.
   3. 튜브 #3("최대" 튜브)을 사용하여 과도한 내독소에 대한 환자의 호중구의 최대 산화 폭발을 측정합니다.
   4. 튜브 #4("LPS" 튜브)를 외인성 내독소의 공급원으로 사용합니다.
   5. 혈액 저장을 위해 튜브 #5("부분 표본" 튜브)를 사용하십시오.
      참고: 검사 중인 각 혈액 샘플에 사용할 총 8개의 튜브에 대해 튜브 #1, #2 및 #3의 복제본이 제공됩니다(파우치에 포함된 모든 검사에는 EA 시약 병 및 품질 관리 테스트를 사용할 수 있음).
4. 콤비 피펫을 사용하여 병의 EA 시약 1mL를 각각 중복된 튜브 #1(Control tube), #2(Sample tube) 및 #3(Max tube)에 피펫으로 넣습니다.
   알림: 용액이 다시 튀는 것을 방지하기 위해 튜브 측면을 피펫으로 내리십시오.
5. 채혈 튜브를 20회 부드럽게 뒤집어 환자 혈액 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 환자 혈액 0.5mL를 튜브 #4(LPS max 튜브)와 튜브 #5(부분 표본 튜브)에 피펫팅합니다. 10초 동안 Vortex tube #4.
6. 모든 EA 시험관이 들어 있는 튜브 랙을 인큐베이터 셰이커에 넣습니다. 뚜껑을 닫고 37°C의 온도에서 10분 동안 배양합니다.
7. 뚜껑을 열고 인큐베이터 셰이커에서 튜브 랙을 제거합니다. 와류 튜브 # 5 (부분 표본 튜브). 멸균 팁을 사용하여 40μL의 혈액을 튜브 #1 및 #2에 복제하여 피펫팅합니다.
8. 와류 튜브 # 4 (LPS 튜브). 동일한 피펫 팁을 사용하여 튜브 #4의 혈액 40μL를 튜브 #3(Max 튜브)에 복제하여 피펫팅합니다.
9. 6개의 최종 시험관(#1, #2, #3 및 각각의 복제본)을 소용돌이친 다음 랙에 다시 놓습니다.
   알림: 모든 튜브가 동일한 시간 동안 와류로 연결되어 있는지 확인하십시오.
10. 튜브 랙을 인큐베이팅 셰이커에 다시 넣고 뚜껑을 닫습니다. 인큐베이팅 셰이커를 100rpm으로 설정한 다음 14분 동안 동작을 시작합니다.
11. EA 라벨이 붙은 칩 카드를 화학광계에 삽입하고 시작을 누릅니다. 14분 배양 후 화학광계에 표시된 지침에 따라 EA 튜브를 올바른 순서로 판독합니다.
12. 화학광계의 샘플 홀더에 놓기 전에 각 튜브를 10초 동안 부드럽게 소용돌이치십시오. 샘플 서랍을 열고 샘플 홀더에 튜브 #1을 놓습니다. 그런 다음 샘플 서랍을 닫고 RLU(Relative Light Unit) 판독값을 기다립니다.
13. 튜브 2 및 튜브 3에 대해 1.12단계를 반복합니다.
14. 중복 튜브 1, 2 및 3.
    에 대해 1.12단계를 반복합니다. 메모: 1.12–1.14 단계에서 동일한 시간 동안 모든 튜브를 와류로 보아 보십시오.
15. 모든 튜브가 처리된 후 EA 결과가 자동으로 계산되고 인쇄됩니다. 수준은 EA 단위로 표시되며 동일한 샘플에서 중복 결정의 평균을 나타냅니다.
16. 검사해야 하는 모든 혈액 샘플에 대해 1.4-1.15단계를 반복합니다.
17. 분석이 완료되면 나머지 시험관과 EA 시약을 2–8°C에서 최대 30일 동안 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
EAA 키트	스펙트럴 메디컬 Inc.	EAAST-20 (이아스트-20	20 테스트 + 1 품질 관리 패키지
스마트 라인 TL	베르톨트	이아슬	광도계
인큐베이터 셰이커	시	ES-20	미니 인큐베이터 쉐이커
소용돌이	폭스바겐	Tel.: 444-2790	와류 계기

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